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    本發明特別是提供式(I)化合物：□用於治療病毒感染或作為免疫抑制劑。
    公开号:TW201300398A
    申请号:TW101110673
    申请日:2012-03-28
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Matthew Alan Gregory；Steven James Moss；Barrie Wilkinson
    申请人:Biotica Tech Ltd；
    IPC主号:C07K5-00
    专利说明:
    新穎化合物及其製造方法
    本發明係關於一種薩菲菌素(sanglifehrin)同系物，其可作為親環素(cyclophilin)抑制劑使用，例如在治療經由病毒例如C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)及人類免疫缺陷病毒(HIV)的病毒感染，及/或作為免疫抑制劑例如用於預防移植排斥及作為抗發炎劑例如用於發炎疾病。本發明也提供其在醫學中的使用方法，特別是用於治療HCV或HIV感染及作為免疫抑制劑或抗發炎劑用在其中抑制粒腺體過渡性通透孔(mPTP)是有用的疾病例如肌肉萎縮症或在生產其他醫學上有用的化合物中作為中間物。 C型肝炎
    C型肝炎病毒(HCV)是一種正鏈RNA病毒，且感染是輸血後肝炎之主要原因。HCV是最常見的慢性血源性感染，且在美國是肝病死亡之主要原因。世界衛生組織估計HCV感染的慢性帶原者超過170百萬人，其係約世界人口的3%。在未經治療的HCV-感染病人中，約70%-85%發展成慢性HCV感染，且因此是在高風險發展成肝硬化及肝細胞癌。在已開發國家中，50-76%的全部肝癌病例及三分之二的全部肝臟移植是因為慢性HCV感染(Manns et al,2007)。
    除了肝病之外，慢性感染的病人也可能發展成其他慢性HCV-相關的疾病，並作為傳輸成其他疾病的根源。HCV感染造成非肝臟併發症例如關節痛(關節疼痛)、皮疹、及主要是腎臟之內臟器官傷害。HCV感染代表一個重要的全球醫療負擔，且目前沒有C型肝炎的疫苗(Strader et al.,2004；Jacobson et al.2007；Manns et al.,2007；Pawlotsky,2005；Zeuzem & Hermann,2002)。 HCV之治療
    現行護理的標準(SoC)是皮下注射聚乙二醇干擾素-α(pIFNα)及口服給藥抗病毒劑利巴威林(ribavirin)經24-48週。成功治療是經由病毒持續性反應(SVR)定義，其係經由在治療結束及6個月後，血清中沒有HCV RNA而定義。SoC的整體反應速率主要取決於基因型式及治療前HCV RNA程度。基因型2及3的病人比感染基因型1的病人更可能回應SoC(Melnikova,2008；Jacobson et al.,2007)。
    相當數量的HCV病人對於SoC治療沒有適當地反應，或因為副作用而無法忍受醫療，導致完成全程的經常性議題。SoC之整體臨床SVR率只有約50%(Melnikova,2008)。產生抗藥性是治療失敗的另一個基本原因(Jacobson et al.et al.2007)。SoC也為不被視為治療的候選者之一些病人的禁忌，例如過去有明顯發作憂鬱症或心臟疾病的病人。SoC的副作用，其經常導致治療中斷，包括類似感冒的疾病、發燒、疲勞、血液疾病、貧血、白血球減少症、血小板減少症、掉髮及憂鬱症(Manns et al.,2007)。
    考慮與長期治療使用SoC相關的副作用、抗藥性的發展、及次優的整體成功率，更有效及安全的新治療急需用於治療HCV感染。新治療的目標包括改進功效、改進毒性情形、改進抗藥性情形、改進生活的品質並因此改進病人順從性。HCV具有短的生命週期且因此在藥物治療期間產生抗藥性很普遍。
    正在研發C型肝炎之新穎、專一性的標靶抗病毒治療(STAT-C)，也稱為直接作用抗病毒(DAA)藥劑，其係尋標病毒蛋白質例如病毒RNA聚合酶NS5B或病毒蛋白酶NS3(Jacobson et al,2007；Parfieniuk et al.,2007)。此外，新穎的化合物也正被研發，其尋標人類蛋白(例如親環素)而不是病毒標靶，其可預期在藥物治療期間減少發生抗藥性(Manns et al.,2007；Pockros,2008；Pawlotsky J-M,2005)。 親環素抑制劑
    親環素(CyP)是一種細胞蛋白質家族，其顯現肽基-丙基順-反異構物酶活性促進蛋白質構形變化及折疊(folding)。CyPs涉及細胞歷程例如轉錄調節、免疫反應、蛋白質分泌、及粒腺體功能。HCV病毒在人類感染期間在其生命週期內募集CyPs。原先認為CyPs刺激促進RNA複製之HCV非結構性蛋白質NS5B RNA聚合酶的RNA結合活性，雖然數個替代假設已提出，包括需要CyP PPIase活性。CyPs的多種異構物，包括A及B，咸信涉及HCV生命週期(Yang et al.,2008；Appel et al.,2006；Chatterji et al.,2009；Gaither et al.,2010)。在老鼠(Colgan et al.,2000)及人類T細胞(Braaten and Luban,2001)產生剔除的能力指出CyPA對於細胞生長及存活為選擇性的。類似結果經CyPA同源物在細菌(Herrler et al.,1994)、鏈孢霉(Neurospora)(Tropschug et al.,1989)及釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Dolinski et al.1997)中的破壞已觀察到。因此，抑制CyPs代表一種新穎且吸引人之用於治療HCV感染的宿主標靶，及除了目前SoC或STAT-C/DAA藥物之外的一種新潛在方法，目的是增加SVR，防止出現抗藥性及減低治療的副作用。
    環孢素A(Inoue et al.2003)(“CsA”)及其密切結構相關的非免疫抑制性臨床同系物DEBIO-025(Paeshuyse et al.2006；Flisiak et al.2008)、NIM811(Mathy et al.2008)及SCY-635(Hopkins et al.,2009)是已知結合至親環素，且作為親環素抑制劑經在試管內證明及在HCV感染之臨床功效(Crabbe et al.,2009；Flisiak et al.2008；Mathy et al.2008；Inoue et al.,2007；Ishii et al.,2006；Paeshuyse et al.,2006)。雖然在CsA上較早期的抗藥性研究在HCV NS5B RNA聚合酶顯現突變且建議只有親環素B涉及HCV複製歷程(Robida et al.,2007)，最近的研究建議親環素A在HCV複製之必要角色(Chatterji et al.2009；Yang et al.,2008)。考慮在NS5A病毒蛋白質中的突變也與CsA抗藥性相關，NS5A由於其特定的肽基-丙基順-反異構物酶(PPIase)活性而與CyPA及CyPB兩者相互作用，另外建議兩種親環素在病毒生命週期中的角色(Hanoulle et al.,2009)。
    環孢素同系物之抗HCV效應是與免疫抑制性質無關，其係取決於鈣調磷酸酶(calcineurin)。此指出HCV活性之必要需求是CyP結合且不需要鈣調磷酸酶結合。DEBIO-025，用於治療HCV的臨床上最先進的親環素抑制劑，在試管內及活體內證明對抗四種最盛行的HCV基因型(基因型1、2、3及4)之功效。抗藥性研究顯示突變授與對DEBIO-025抗藥性是不同於對聚合酶及蛋白酶抑制劑之報導，且對耐STAT-C/DAA的病毒複製沒有交叉抗藥性。更重要的是，DEBIO-025也預防逃逸突變之發展，其授與對聚合酶及蛋白酶抑制劑之抗藥性(Crabbe et al.,2009)。
    但是，CsA-基質的親環素抑制劑在臨床發展上具有多個問題，咸信是與其共有的結構種類相關，包括：某些負面事件其可導致撤回治療並具有有限的臨床劑量程度；可變的藥物動力學其可導致可變的功效；及增加藥物-藥物相互作用的風險其可導致劑量問題。
    在接受DEBIO-025的病人中最經常發生的負面事件(AEs)包括黃疸、腹痛、嘔吐、疲勞、及發熱。最重要的臨床AEs是高膽紅素血症及血小板計數減少(血小板減少症)。Peg-IFN可造成嚴重的血小板減少症且與DEBIO-025組合可代表一個重大的臨床問題。使用NIM-811造成增加膽紅素及減少血小板也經報導在早期的臨床研究中(Ke et al.,2009)。雖然治療停止後，在DEBIO-025臨床研究期間觀察到的高膽紅素血症經逆轉，其為16個病人中4個停止治療之原因，並減少劑量程度於未來的試驗。由於親環素抑制劑在HCV中的抗病毒效應是與劑量相關，降低劑量導致降低抗病毒效應，且用CsA-基質的親環素抑制劑之個後續試驗證明當作為單獨治療的劑量時，沒有或較差的HCV病毒載量減少(Lawitz et al.,2009；Hopkins et al.,2009；Nelson et al.,2009)。DEBIO-025及環孢素A已知是膽汁傳輸體例如膽汁鹽輸出泵及其他肝輸出體(尤其是OAT1B1/OAT1B3/MRP2/MRP3/cMOAT/ABCC2)之抑制劑(Crabbe et al.,2009)。曾經建議與膽汁轉運體特別是MRP2之相互作用，可能是在高劑量程度的DEBIO-025所見的高膽紅素血症之原因(Nelson et al.,2009,Wring et al.,2010)。經由抑制其他藥物轉運體例如P-糖蛋白(Pgp/MDR1)、BSEP、OAT1B1及OAT1B3之CsA類-相關的藥物-藥物相互作用(DDIs)(Konig et al.,2010)也可能是一個問題，可能限制某些組合及用於進行治療共同感染例如HIV的部份病人(Seden et al.,2010)。
    而且，DEBIO-025及環孢素A是經由細胞色素P450(尤其是CYP3A4)代謝的基質，且已知是人類P-糖蛋白(MDR1)之基質與抑制劑(Crabbe et al.,2009)。環孢素A也在試管內證明是CYP3A4之抑制劑(Niwa et al.,2007)。此表示可能增加與CYP3A4基質、引發劑或抑制劑的其他藥物例如克康那唑(ketoconazole)、西咪替丁(cimetidine)及立泛黴素(rifampicin)產生藥物-藥物相互作用的風險。此外，也預期與經由P-糖蛋白輸送的藥物(例如毛地黃(digoxin))有相互作用，其可能在接受醫學治療於其他伴隨疾病之HCV病人中造成嚴重的藥物-藥物相互作用(Crabbe et al.2009)。也已知CsA具有高度變化的藥物動力學，早期的調製物顯示口服生物利用度從1-89%(Kapurtzak et al.,2004)。沒有昂貴地監測病人的血液濃度，因為增加血漿濃度而可導致增加副作用的發病率，或因為降低血漿濃度而降低臨床反應。
    考慮抑制環親素是代表用於治療HCV之一個可行的新方法，需要尋找及研發更有效及安全的CyP抑制劑用於對抗HCV感染之組合治療。 薩菲菌素
    薩菲菌素A(SfA)及其天然的同類物屬於一種混合的非-核糖體肽/聚酮類化合物(polyketides)，經由鏈黴菌A92-308110生產(也稱為DSM 9954)(見WO 97/02285)，其最初是根據其對親環素A的高親和力而被發現(CyPA)。SfA是發酵液中最豐富的成份並展現對CyPA的親和力約20倍高於CsA。此導致建議薩菲菌素可以用於治療HCV(WO2006/138507)。薩菲菌素也經證明在試管內測試時展現比CsA較低的免疫抑制活性(Sanglier et al.,1999；Fehr et al.,1999)。SfA在高親和力下結合至CyPA之CsA結合位置(Kallen et al.,2005)。
    薩菲菌素之生物合成
    薩菲菌素是經由混合的聚酮類化合物合成酶(PKS)/非-核糖體肽合成酶(NRPS)而生物合成(見WO2010/034243)。該22-員大環內酯類主鏈包含聚酮類化合物碳鏈及三肽鏈。該肽鏈係由一個天然的胺基酸、纈胺酸及兩個非天然的胺基酸組成：經由醯胺鍵連接之(S)-間位-酪胺酸及(S)-六氫吡酸。苯基丙胺酸之羥基化(不論是當場在NRPS上或在生物合成前)而產生(S)-間位-酪胺酸咸信是經由sfaA之基因產物而發生。 薩菲菌素之免疫抑制作用
    SfA的作用之免疫抑制是不同於其他已知的親免疫素結合性免疫抑制藥物例如CsA、FK506及雷帕黴素(rapamycin)。SfA不會抑制CsA標靶之鈣調磷酸酶的磷酸酶活性(Zenke et al.2001)，取而代之的是其免疫抑制活性是歸因於抑制白介素-6(Hartel et al.,2005)、白介素-12(Steinschulte et al.,2003)及抑制白介素-2-相關的T細胞增生(Zhang & Liu,2001)。但是，SfA經由其展現免疫抑制效應的分子標靶及機制迄今還未知。
    SfA之分子結構是複雜且其與CyPA之相互作用咸信主要是經由分子的大環部份居間影響。事實上，衍生自SfA的氧化性解離之大環化合物(羥基大環)經證明對CyPA有強烈的親和力(Sedrani et al.,2003)。X-光晶體結構數據證明羥基大環結合至CyPA的相同活性位置如同CsA。根據SfA的大環部份之類似物先前經證明沒有免疫抑制性質(Sedrani et al.,2003)，提供機會供設計非-免疫抑制性CyP抑制劑用在HCV醫療之潛在用途。
    相對於此點，也有一個機會研發低毒性的免疫抑制劑用於此領域作為預防移植排斥、自發免疫、發炎及呼吸疾病，包括但不限於Crohn氏病、Behcet徵候群、葡萄膜炎、銀屑病、異位性皮膚炎、類風濕性關節炎、腎病徵候群、再生障礙性貧血、膽汁性肝硬化、氣喘、肺間質纖維化、慢性阻塞性肺病(COPD)及腹腔疾病。薩菲菌素經證明具有新穎機制的免疫抑制活性(Zenke et al.,2001)，可以透過樹突狀細胞趨化因子作用(Immecke et al.,2011)，且因此有機會研發不同於現有臨床藥物例如環孢素A、雷帕黴素及FK506的作用機制之藥物。薩菲菌素A經證明10倍低於環孢素A的效應，所以理想的新穎藥物將具有改進的功效及/或治療窗口(therapeutic window)。 親環素抑制劑之其他醫療用途人類免疫缺陷病毒(HIV)
    親環素抑制劑例如CsA及DEBIO-025也證實潛在效用於抑制HIV複製。親環素抑制劑在HIV逆轉錄的進行/完成期間干擾CyPA的功能(Ptak et al.,2008)。但是，當臨床測試時，DEBIO-025分別在9及兩個病人只降低HIV-1RNA程度0.5及>1 log10份/毫升，而27個經治療的病人顯示沒有降低HIV-1 RNA程度(Steyn et al.,2006)。根據此點，DEBIO-025在HCV/HIV共同感染的病人中試驗，且顯示較佳的功效對抗HCV，並停止HIV臨床試驗(見Watashi et al.,2010)。 HIV之治療
    世界上超過30百萬人感染HIV-1，每年有3百萬新案例。引進高活性抗逆轉錄療法(HAART)後的治療方案經明顯改善(Schopman et al.,2010)。在2008年，約25種抗逆轉錄藥物經許可用於治療HIV-1，包括9種核苷逆轉錄酶抑制劑(NRTI)、4種非核苷逆轉錄酶抑制劑(NNRTI)、9種蛋白酶抑制劑(PI)、1種融合抑制劑、1種CCR5抑制劑及1種整合酶抑制劑(Shafer and Schapiro,2008)。但是，這些目前方案沒有一種導致完全病毒清除，其可導致嚴重的副作用且抗病毒抗藥性仍然是一個主要的問題。因此，仍然保留需求於新的抗病毒療法，尤其是在作用機制種類中沒有核准的藥物，例如在親環素抑制劑之情形。 B型肝炎病毒
    B型肝炎是肝炎病毒科中的一種DNA病毒，且是B型肝炎的病原體。異於HCV及HIV之情形，只有非常少數親環素抑制劑對抗B型肝炎病毒之活性經公告。Ptak et al.2008敘述Debio-025對抗HBV之弱活性(IC50是4.1微莫耳濃度)，而Xie et al.,2007敘述CsA對抗HBV的部份活性(IC50>1.3微克/毫升)。此點異於HIV及HCV，其中有親環素抑制劑在毫微莫耳濃度活性的許多報導。 HBV之治療
    HBV在世界上感染高達400百萬人且是慢性病毒肝炎及肝細胞癌的主要原因。截至2008，有六種藥物核准用於治療HBV：干擾素α及聚乙二醇化的干擾素α、三種核苷同系物(拉米夫定(lamivudine)、恩替卡偉(entecavir)及替比夫定(telbivudine))及一種核苷酸同系物(阿德福偉(adefovir dipivoxil))。但是，因為高比例的抗藥性、不良的耐受度急可能的副作用，需要新的醫療方案(Ferir et al.,2008)。 粒腺體過渡性通透孔(mPTP)之抑制作用
    在粒腺體中打開高傳導過渡性通透孔啟動粒腺體通透性轉化(MPT)。這是一種致病事件，在氧化應激、Ca2+毒性、及缺血/再灌流之後在肝細胞中導致壞死及凋亡。親環素D(也稱為親環素F)經由親環素抑制劑之抑制作用經證明在這些應激後阻止打開過渡性通透孔並保護細胞死亡。親環素D抑制劑因此可以用於其中涉及打開mPTP之適應症，例如肌肉萎縮症特別是Ullrich先天性肌肉萎縮症及Bethlem肌病(Millay et al.,2008,WO2008/084368,Palma et al.,2009)、多發性硬化症(Forte et al.,2009)、糖尿病(Fujimoto et al.,2010)、肌萎縮性側索硬化症(Martin 2009)、雙相障礙(Kubota et al.,2010)、阿茲海默氏症(Du and Yan,2010)、Huntington氏病(Perry et al.,2010)、心肌梗塞後的恢復(Gomez et al.,2007)及慢性酒精消耗(King et al.,2010)。 其他醫療用途
    親環素抑制劑具有潛在的對抗活性且因此用於治療其他病毒感染，例如Varicella-zoster病毒(Ptak et al.,2008)、Influenza A病毒(Liu et al.,2009)、嚴重急性呼吸道徵候群冠狀病毒及其他人類與貓冠狀病毒(Chen et al.,2005,Ptak et al.,2008)、Dengue病毒(Kaul et al.,2009)、黃熱病病毒(Qing et al.,2009)、West Nile病毒(Qing et al.,2009)、西方馬腦炎病毒(Qing et al.,2009)、巨細胞病毒(Kawasaki et al.,2007)及牛痘病毒(Castro et al.,2003)。
    也有親環素抑制劑及親環素抑制作用在其他醫療領域的用途之報導，例如在癌症(Han et al.,2009)。 薩菲菌素之一般性評論
    在化合物例如薩菲菌素的藥物研發中的議題之一是快速代謝及葡萄糖醛酸化作用，導致低口服生物利用度。此可導致增加食物效應的機率、更經常從給藥形式之不完全釋放及更高病人之間的變化。
    因此持續有需求以辨認新穎的親環素抑制劑，其具有用途，特別是在治療HCV感染，以及在治療其他疾病領域其中親環素之抑制作用具有用處，例如HIV感染、肌肉萎縮症或幫助肌肉萎縮症後的恢復或其中免疫抑制或抗發炎效應具有用處。較宜，此親環素抑制劑具有改良的性質超越目前供應的親環素抑制劑，包括一或多種下面的性質：較長的半衰期或增加口服生物利用度，可能經由降低P450代謝及/或降低葡萄糖醛酸化作用、改良的水溶性、改良對抗HCV之功效、降低毒性(包括肝毒性)、改良的藥理學，例如高暴露至標靶器官(例如在HCV情形之肝臟)及/或長半衰期(可減少用藥次數)、減低藥物-藥物相互作用，例如經由降低CYP3A4代謝及抑制作用的程度及降低(Pgp)抑制作用(可以較容易多種藥物組合)及改良副作用，例如低結合至MRP2，導致減少高膽紅素血症之機會、降低免疫抑制效應、改良活性對抗耐藥性病毒物種，特別是CsA及CsA同系物(例如DEBIO-025)耐藥性病毒物種及更高的醫療(及/或選擇性)指數。本發明揭示一種新穎的薩菲菌素同系物其具有一或多種上述性質。具體地說，本發明揭示一種新穎的突變合成(mutasynthetic)薩菲菌素同系物，預期其具有降低的代謝經由P450或葡萄糖醛酸化作用，例如經由增加微粒體半衰期證明及/或降低改良對抗HCV之功效，例如經由低複製子EC50證明。
    此外，也需要研發新穎的免疫抑制劑，其可用在預防移植排斥、或在治療自發免疫、發炎及呼吸道疾病。較宜，此免疫抑制劑將具有改良的性質超越已知的天然薩菲菌素，包括一或多種下面的性質：較長的半衰期或增加口服生物利用度，可能經由降低P450代謝及/或降低葡萄糖醛酸化作用、改良的水溶性、改良在免疫抑制活性之功效例如在T-細胞複製測試中所見、降低毒性(包括肝毒性)、改良的藥理學，例如高暴露至標靶器官及/或長半衰期(可減少用藥次數)、減低藥物-藥物相互作用，例如經由降低CYP3A4代謝及抑制作用的程度及降低(Pgp)抑制作用可以較容易多種藥物組合)及改良副作用。本發明揭示一種新穎的薩菲菌素其具有一或多種上述性質。具體地說，本發明揭示一種新穎的衍生物，其具有降低的代謝經由P450或葡萄糖醛酸化作用，例如經由增加微粒體半衰期證明及/或改良的免疫抑制功效，例如經由低T細胞複製IC50證明。
    據此，從實例可以看出，本發明化合物具有下面有利的醫療相關性質：-與先前技藝親環素抑制劑環孢素A、DEBIO-025(阿立泊(alisporivir))及薩菲菌素A比較，具有改良的抗病毒功效對抗HCV及HIV；-與先前技藝化合物薩菲菌素A比較，具有降低的淨空(reduced clearance)並增加口服暴露；-與先前技藝親環素抑制劑環孢素A、DEBIO-025(阿立泊)及薩菲菌素A比較，具有更有效的CypA PPIase活性抑制作用；-經由降低膽紅素轉運體(OATP-1B1、OATP-1B3、MRP2及MRP3)的抑制作用及降低外來有害物轉運體(Pgp及BSEP)的抑制作用證明，具有改良的副作用情形及降低藥物-藥物相互作用。 發明概述
    本發明提供一種新穎的巨環薩菲菌素同系物，其係經由突變合成的薩菲菌素之半合成改良而產生。產生此同系物可以經由二羥基化突變合成的薩菲菌素，例如在式IIA及式IIB中的敘述，隨後經由解離而產生醛巨環，隨後經由其他化學，包括Horner-Emmons型反應及涉及醛之其他偶合反應。據此，本發明提供一種巨環薩菲菌素同系物，製備此化合物之方法，此化合物在醫學或在生產其他化合物時作為中間物的使用方法。
    因此，在第一個方面，本發明提供一種根據下面式(I)之巨環薩菲菌素同系物，或其藥學上可接受的鹽： 包括其任何互變異構物；且包括其甲醇加成物，其中縮酮是經由結合C-53酮基及C-15羥基與甲醇而形成。
    上面結構顯示一個代表性的互變異構物且本發明包括式(I)化合物之全部互變異構物例如酮基化合物，其中敘述烯醇化合物或反之亦同。
    包括在式(I)定義中的特定互變異構物是彼等其中(i)C-53酮基與C-15羥基形成半縮酮，或(ii)C-15及C-17羥基可以與C-53酮基結合而形成縮酮。全部的編號使用母薩菲菌素A結構之系統。
    式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽，可以隨意地存在為藥學上可接受的溶劑化物之形式，例如水合物。 定義
    此處使用的「一個(a)」或「一個(an)」物件係指一個或超過一個(也就是至少一個)該物件之語法對象。例如「一種同系物」係指一種同系物或一種以上的同系物。
    在本文使用時，「同系物」一詞係指化學化合物其係結構上類似於其他化合物但其稍微不同於組成物(例如一個原子經另一個原子取代或存在或不存在特定的官能基)。
    在本文使用時，「薩菲菌素」一詞係指化學化合物其係結構上類似於薩菲菌素A但其稍微不同於組成物(例如一個原子經另一個原子取代或存在或不存在特定的官能基)，特別是彼等經由鏈黴素A92-308110之發酵而產生者。實例包括揭示在WO97/02285及WO98/07743的類薩菲菌素化合物，例如薩菲菌素B。
    在本文使用時，「突變合成的薩菲菌素」或「突變合成的薩菲菌素同系物」一詞係指係指化學化合物其係結構上類似於薩菲菌素A、B、C或D但其稍微不同於組成物(例如一個原子經另一個原子取代或存在或不存在特定的官能基)，特別是彼等經由鏈黴素A92-308110或其突變物之發酵而產生者，其中培養液是餵食間-酪胺酸同系物。
    在本文使用時，「間-酪胺酸同系物」一詞係指化學化合物，其係結構上類似於間-酪胺酸但其稍微不同於組成物(例如一個原子經另一個原子取代或存在或不存在特定的官能基)，特別是彼等在式(III)揭示者。
    在本文使用時，「巨環同系物」、「巨環薩菲菌素同系物」或「巨環薩菲菌素」一詞係指上面本發明在其最廣方面代表的化合物，例如上面根據式(I)之化合物，或其藥學上可接受的鹽。這些化合物也稱為「本發明化合物」或「薩菲菌素衍生物」或「薩菲菌素同系物」且這些名詞是在本申請案中交互使用。
    在本文使用時，「HCV」一詞係指C型肝炎，在黃熱病病毒科中的單鏈RNA包膜病毒。
    在本文使用時，「HIV」一詞係指人類免疫缺陷病毒，人類後天免疫缺陷徵候群之病原體。
    在本文使用時，「生物可利用度」一詞係指藥物或物質投藥後經吸收或變成可用在生物活性位置之程度或速率。此性質係取決於多個因子包括化合物之溶解度、在腸道吸收的速率、蛋白質結合的程度及代謝等。從事此項技藝者已知的生物可利用度之多種測試法在文中說明(也見Egorin et al.2002)。
    在本文使用時，「水溶解度」一詞係指在水性介質例如pH 7.4的磷酸鹽緩衝化的鹽水(PBS)或5%葡萄糖溶液中的溶解度。水溶性的測試是在下面實例中的「水溶解度測試法」中提供。
    本發明化合物例如式(I)化合物之藥學上可接受的鹽，包括從藥學上可接受的無機或有機酸或鹼形成的鹽以及四級銨酸加成鹽。合適的酸鹽之更特定的實例包括氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、過氯酸、富馬酸、醋酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、巴莫酸、丙二酸、羥基馬來酸、苯基醋酸、穀胺酸、苯甲酸、水楊酸、富馬酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羥基萘酸、氫碘酸、蘋果酸、硬脂酸、單寧酸等。特別有價值的是氫氯酸鹽。其他酸例如草酸，其本身酸然不是藥學上可接受，可以在製備有價值的鹽類中作為中間物使用而得到本發明化合物及其藥學上可接受的鹽類。合適的鹼性鹽類之更特定實例包括鈉、鋰、鉀、鎂、鋁、鈣、鋅、N,N’-二苄基乙二胺、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺及普魯卡因鹽。下面所提到的根據本發明之化合物包括式(I)化合物及其藥學上可接受的鹽類。
    在本文使用時，「烷基」一詞代表直鏈或支鏈烷基，通常含有1-10個碳原子，例如C1-6烷基。烷基之實例包括C1-4烷基例如甲基、乙基、正丙基、異丙基及正丁基。
    「治療」一詞預防性及醫療性治療。
    「式II」一詞係指式IIA及式IIB之統稱。 發明說明
    本發明提供上述之巨環薩菲菌素同系物，此化合物之製備方法及此化合物在醫學中的使用方法。
    在一個具體實施例中，該化合物是一種其甲醇加成物，其中是經由組合C-53酮基及C-15羥基與甲醇而形成半縮醛。在另一個具體實施例中，其不是甲醇加成物。
    在本發明之一個具體實施例中，在C26、27位置之雙鍵是在順式形式，如下式之代表：
    此化合物可以在化學合成過程中生產。
    一般而言，製備本發明化合物是經由突變合成而產生式(II)化合物，隨後經由半合成。
    一般而言，製備式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽類之方法包括：●接種薩菲菌素產生劑(例如鏈黴菌屬A92-308110，也稱為DSM 9954)或更宜是具有去活化或刪除的sfaA基因或sfaA基因同源物的薩菲菌素產生劑於發酵液；●用間-酪胺酸同系物(如式(III)所示，例如(S)-2-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯，DL-5-氟-間-酪胺酸(9)或2-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯(10))餵食發酵液；●使發酵持續至產生式IIA及式IIB化合物；●半合成衍生化式IIA及式IIB化合物而產生式I化合物。
    式III化合物是定義如下： 其中R10代表H或酯形成基例如烷基例如C1-6烷基例如Me。
    該餵食料可以是外消旋性或L-形式之式(III)化合物。
    式(III)化合物可以得自商業化供應或經由標準有機合成化學技術製備。式(III)化合物之一個通用途徑是在下面圖式1a所示。
    圖式1a：a)偶合式(IV)之醛與合適的碎段例如(R11O)2P(O)CH(NHPG)CO2R10，及b)氫化且視需要去除保護。PG=保護基。
    式(IV)之醛可以得自商業化供應或經由從事此項技藝者輕易地合成。從式(IV)化合物產生式(III)化合物時可能需要使用保護及去除保護化學。這些技術是從事此項技藝者已知且合適的保護基是揭示在Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis(Wuts and Greene,4th Edition,2007)。
    產生式(IIA)及式(IIB)化合物之後，經由半-合成衍生化而製備本發明化合物。用於產生薩菲菌素巨環醛之半合成法是揭示在US6,124,453,Metternich et al.,1999,Banteli et al.,2001及Sedrani et al.,2003。
    一般而言，用於從薩菲菌素突變合成的同系物製備某些式(I)化合物或其藥學上可接受的鹽類之方法包括：(a)二羥基化薩菲菌素同系物；(b)氧化性解離1,2-二醇而得到醛；及(c)使用式V化合物，偶合該醛與安定化的碳陰離子(或其標準形式(canonical form))，例如磷酸根碳陰離子。
    此逆向合成顯示如下： 其中對於薩菲菌素A突變合成同系物，R12= R11基可以相同或不同，獨立地代表烷基(例如C1-4烷基)或苄基。
    因此，用於製備本發明化合物之方法包括使式(V)化合物與醛系巨環(式(VI)化合物)反應。製備式(VI)化合物可以經由上述用於轉化薩菲菌素A成為其對應的醛系巨環之方法(Metternich et al.1999)進行。簡要地說，使用改良的Sharpless條件(催化性四氧化鋨)將式(II)化合物二羥基化。使用對掌性配體幫助促進選擇性。隨後使用例如過碘酸鈉氧化性解離所得的二醇。所得的式VI化合物隨後可以作為作用物用於衍生化成同源的醯胺、酯或酮。通常將式(V)化合物溶解在非質子溶劑中，冷卻並用鹼例如氫化鈉處理。隨後加入式(VI)化合物並在溫熱的溫度下反應。經適當時間後停止反應並經由標準條件純化式I化合物(例如製備級HPLC、製備級TLC、正常相快速層析法等)。
    式(V)化合物是已知或可使用已知的方法製備。
    如圖式1(下面)所示，合適的胺可以用於處理氯乙醯氯或類似物而形成α-氯醯胺。然後將α-氯醯胺在Arbuzov反應中處理而產生式V化合物。從事此項技藝者將可理解得到式V化合物之其他途徑。
    流程圖1
    其他式(V)化合物是已知或如流程圖2所示從可得到的羧酸衍生物(例如R3COX)其中R3是1,2-烷環輕易地合成。如流程圖2所示(下面)，該羧酸衍生物在磷酸酯用鹼處理後可以偶合至磷酸甲酯上。此得到式(V)化合物，雖然從事此項技藝者將可理解得到式V化合物之其他途徑。
    流程圖2
    如果需要或必要時，可以使用保護基保護在醛系巨環或巨環、或在式V化合物中的官能基，如揭示在T.W.Green,P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,Wiley-Interscience,New York,1999。
    除了本文中提供的特定方法及參考文獻外，從事此項技藝者也可以參照標準教科書文獻中的合成方法，包括但不限於Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry(Furniss et al.,1989)及March’s Advanced Organic Chemistry(Smith and March,2001)。
    根據本發明之薩菲菌素同系物可以單獨或結合其他醫療劑投藥。兩種(或多種)藥物共同投藥可以減低各使用藥物之劑量，因而降低副作用，可以導致改進功效且因此更高的SVR，並減少抗藥性。
    因此在一個具體實施例中，突變合成的薩菲菌素同系物是與一或多種用於治療HCV感染的藥物共同投藥，從護理治療的標準考量。此藥物可以是干擾素(例如pIFNα及/或利巴偉林(ribavirin))。
    在一個替代的具體實施例中，本發明之薩菲菌素巨環是與一或多種抗病毒藥物例如STAT-C(用於治療HCV的特定標靶藥物)或DAA(直接作用)共同投藥，其可以是一或多種下面的藥物：非核苷聚合酶抑制劑(例如ABT-333、ABT-072、BMS 791325、IDX375、VCH-222、BI 207127、ANA598、VCH-916、GS 9190、PF-00868554(Filibuvir)或VX-759)、核苷或核苷酸聚合酶抑制劑(例如2’-C-甲基胞苷、2’-C-甲基腺苷、R1479、PSI-6130、R7128、R1626、PSI 7977或IDX 184)、蛋白酶抑制劑(例如ABT-450、ACH-1625、BI 201355、BILN-2061、BMS-650032、CTS 1027、Danoprevir、GS 9256、GS 9451、MK 5172、IDX 320、VX-950(Telaprevir)、SCH503034(Boceprevir)、TMC435350、MK-7009(Vaneprivir)、R7227/ITMN-191、EA-058、EA-063或VX 985)、NS5A抑制劑(例如A-831、BMS 790052、BMS 824393、CY-102或PPI-461)、水飛薊素、NS4b抑制劑、絲胺酸C-棕櫚烯基轉移酶抑制劑、硝唑尼特(Nitazoxanide)或病毒進入抑制劑(例如PRO 206)。
    在一個替代的具體實施例中，本發明之薩菲菌素巨環是與用於治療HIV之一或多種其他抗病毒劑(例如高活性抗逆轉錄病毒療法(HAART))一起投藥，其可以是一或多種下面的藥物：核苷逆轉錄酶抑制劑(NRTI)(例如恩曲他濱(Emtricitabine)或泰諾福偉(Tenofovir))、非核苷逆轉錄酶抑制劑(NNRTI)(例如利匹維林(Rilipivirine)或依非維佗(Efavirenz))、蛋白酶抑制劑(PI)(例如利托那維(Ritonavir)或羅匹那維(Lopinavir))、融合抑制劑(例如馬拉維諾(Maraviroc)或恩夫維地(Enfuvirtide))、CCR5抑制劑(例如阿拉維羅(Aplaviroc)或偉克羅(Vicriviroc))、成熟抑制劑(例如貝維利馬(Bevirimat))、CD4單株抗體(例如依貝利馬(Ibalizumab))及整合酶抑制劑(例如艾地格維(Eltiegravir))。
    在一個替代的具體實施例中，本發明之薩菲菌素巨環是與用於治療HBV之一或多種其他抗病毒劑一起投藥，其可以是一或多種下面的藥物：干擾素(例如干擾素α或長效型干擾素α)、核苷或核苷酸同系物(例如拉米夫定(lamivudine)、恩替卡維(entecavir)、阿德福維酯(adefovir dipivoxil)或喜必福(telbivudine))、其他免疫調節劑(例如胸腺肽α(Thymosin alpha)、CYT107或DV-601)或HMG CoA還原酶抑制劑(例如辛伐他汀(Simvastatin))。
    該調製物可以在單元給藥形式下傳統地呈現且可以經由藥學技藝中熟知的任何方法製備。這些方法包括將活性成份(本發明化合物)與構成一或多種附加成份的載劑結合之步驟。一般而言，該調製物是經由將活性成份與液體載劑或微細分開的固體載劑或兩者均勻且緊密地結合，且隨後如果需要時，使產物成形。
    本發明化合物通常是在含有活性成份的醫藥調製物之形式、隨意地在無毒有機或無機酸或鹼加成鹽之形式、藥學上可接受的給藥形式下口服投藥。取決於疾病及被治療的病人，以及投藥途徑，該組成物可以在不同的劑量下投藥。
    例如，本發明化合物可以在錠劑、膠囊劑、卵囊劑、酏劑、溶液或懸浮液之形式下，其可以含有調味或染色劑，供立即-、延遲-或控制性釋放應用，經由口服、頰內或舌下投藥。
    這些錠劑可以含有賦形劑例如微晶纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、二元磷酸鈣及甘油，分解劑例如澱粉(較宜是玉米、馬鈴薯或木薯澱粉)、澱粉乙醇酸鈉及某些複合矽酸鹽，以及粒化黏著劑例如聚乙烯吡咯酮、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、羥基-丙基纖維素(HPC)、蔗糖、明膠及阿拉伯膠。另外，可以含有潤滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸、扁油酸甘油酯及滑石。
    類似種類之固體組成物也可以在明膠膠囊劑中作為填充物使用。這方面的較佳賦形劑包括乳糖、澱粉、纖維素、乳糖或高分子量聚乙二醇。對於水性懸浮液及/或酏劑，本發明化合物可以結合多種甜化劑或調味劑、染色物質或染劑乳化劑及/或懸浮劑與稀釋劑例如水、乙醇、丙二醇及甘油、及其組合。
    錠劑可以經由擠壓或模塑製成，隨意地含有一或多種必要成份。擠壓的錠劑可以在合適的機器中擠壓自由流動形式例如粉末或顆粒的活性成份而製備，隨意地混合黏著劑(例如聚維酮(povidone)、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、分解劑(例如羧甲基澱粉鈉、交聯的聚維酮、交聯的羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑。模塑的錠劑可以經由在合適的機器中模塑用惰性液體稀釋劑溼潤的粉狀化合物之混合物而製成。錠劑可以隨意地包覆或畫線且可以使用例如提供所要的釋放情形之不同比例的羥丙基甲基纖維素調製而提供從其中緩慢或控制性釋出活性成份。
    根據本發明合適口服投藥之調製物可以存在為分離的單元例如膠囊劑、扁囊劑或錠劑，各含有預先決定量的活性成份；存在為粉末或顆粒；存在為在水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮液；或存在為油在水中的液體懸浮液或水在油中的液體懸浮液。該活性成份也可以存在為大丸劑、膏劑或糊劑。
    除了上面特別提到的成份以外，必須理解本發明之調製物可包含在傳統此項技藝中關於這種調製物的其他物質，例如合適口服投藥的彼等物質可包括調味劑。
    例如防腐劑及緩衝劑之物質適宜溶解在媒劑中。為了增加安定性，組成物填充至小瓶後可以冷凍並在真空下將水移除。隨後將無水冷凍乾燥的粉末密封在小瓶內且可以供應附隨的水瓶供使用前重組。
    本發明化合物之投藥劑量將根據特定化合物、涉及的疾病、患者、及疾病的本質與嚴重度及患者的身體情形、以及選擇的投藥途徑而變化。從事此項技藝者可以容易地決定適當的劑量。
    該組成物可以含有從0.1重量%的本發明化合物，較宜從5-60%，更宜從10-30重量%，取決於投藥方法。
    從事此項技藝者可以理解本發明化合物之最適量及個別給藥的間隔將經由被治療的情形之本質及程度、投藥形式、路徑及部位、及被治療的特定患者之年齡及情形而決定，且醫生將最後決定使用的最合適劑量。此劑量適當時可以多次重複。如果產生副作用時，根據正常臨床實務，給藥的量及/或頻率可以改變或減低。 本發明之其他方面包括：
    -根據本發明之化合物作為藥物使用；-根據本發明之化合物作為藥物使用供治療病毒感染(尤其是RNA病毒感染)例如HCV或HIV感染、供作為抗發炎使用或供預防器官移植排斥；-一種醫藥組成物，其包含根據本發明之化合物以及藥學上可接受的稀釋劑或載劑；一種醫藥組成物，其包含根據本發明之化合物以及藥學上可接受的稀釋劑或載劑，另外含有第二或其他活性成份，尤其是合適用於治療病毒感染例如HCV或HIV感染、供作為抗發炎使用或供預防器官移植排斥之活性成份；-一種治療病毒感染(尤其是RNA病毒感染)例如HCV或HIV感染，供作為抗發炎使用或供預防器官移植排斥之方法，其包括將醫療有效量根據本發明之化合物投藥至患者；-根據本發明之化合物生產藥劑用於治療病毒感染例如HCV或HIV感染、供作為抗發炎使用或供預防器官移植排斥之用途。 一般方法材料及方法菌株及生長條件
    薩菲菌素產生者鏈黴菌A92-308110(DSM no 9954,購自DSMZ,Braunschweig,Germany)也稱為BIOT-4253及BIOT-4370或其衍生物(例如BIOT-4585)是保持在28℃的培養基燕麥瓊脂MAM、ISP4或ISP2(見下文)中。
    將BIOT-4585(施工方法見實例1)在28℃的燕麥瓊脂中生長7-10天。將從瓊脂植物表面的孢子收集至20%重量/體積在蒸餾水的無菌甘油中並以0.5毫升的等份試樣在-80℃儲存。使用冷凍孢子儲備液接種種子培養基SGS或SM25-3。將接種後的種子培養基在27℃在5.0或2.5公分行程在200及300 rpm之間培養24小時。將發酵培養基SGP-2或BT6接種2.5%-10%的種子培養液並在24℃在5或2.5公分行程在200及300 rpm之間培養4-5天。然後將培養液萃取收集。 間-酪胺酸同系物
    (S)-2-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯是購自NetChem(USA)。3-溴-5-氟茴香醚(9-1)是購自Accela ChemBio Co.,Ltd.,(Shanghai,China)且也可以購自Amfinecom Inc(USA)或Apollo Scientific Ltd.(UK)。DL-5-氟-間-酪胺酸(9)及2-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯(10)是根據下面合成： DL-5-氟-間-酪胺酸(9)及2-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯(10)
    在9-1(20克，97.55毫莫耳)於四氫呋喃(100毫升)的溶液中在-78℃逐滴加入正丁基鋰(43毫升，2.5M，107.3毫莫耳)。將其攪拌30分鐘並在此溫度加入N,N-二甲基甲醯胺(15.1毫升，195.1毫莫耳)。將其攪拌30分鐘並將冷卻浴移開。經1小時候，用飽和的氯化銨水溶液將反應淬滅。將有機層用水及飽和的氯化鈉水溶液清洗，乾燥(硫酸鈉)，過濾並濃縮。將殘留物在矽膠上經由層析法純化後得到9-2。
    在9-2(6克，38.9毫莫耳)於無水DCM(200毫升)的溶液中在-70℃逐滴加入BBr3(4M在DCM中，30毫升，116.8毫莫耳)。添加後，將反應混合物在-20℃攪拌3小時，小心加入冰-水並用DCM萃取。將有機層用水及鹽水清洗，經由Na2SO4乾燥。將殘留物在矽膠上經由快速層析法純化後得到標題化合物9-3。
    在2-(苄氧羰基)-2-(二甲氧磷酸)醋酸酯(4.64克，14毫莫耳)於DCM(150毫升)中的溶液在室溫下加入DBU(4.26克，150毫莫耳)。經10分鐘後，加入9-3(1.95克，14毫莫耳)並將所得的混合物在室溫攪拌過夜。將溶液用EtOAc(150毫升)稀釋，分離並將有機層用1N HCl清洗，經由Na2SO4乾燥，過濾並濃縮。將殘留物在矽膠上經由快速層析法純化後得到9-4。
    將9-4(1克)於MeOH(20毫升)中的溶液經由200毫克10% Pd/C在大氣壓力下氫化過夜。經由過濾去除觸媒後，將溶劑蒸發而得到10。
    在10(300毫克，1.4毫莫耳)於EtOH(30毫升)的溶液中加入NaOH水溶液(2N，4毫升)，將反應在室溫攪拌30分鐘。將溶劑移除並將殘留物用2N HCl中和至pH=6並經由過濾將形成的白色晶體收集而得到標把化合物9。 2-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯(10)之替代路徑
    (3,5-二氟溴苯(9a-1)是購自Darui Fine Chemicals Co.,Ltd.,(Shanghai,China)且也可以購自Alfa Aesar或Sigma Aldrich)。
    9a-2之製備
    在BnOH(1.61毫升，15.54毫莫耳)於DMF(30毫升)的溶液中在0℃加入NaH(622毫克，60%在礦物油中的分散液，15.54毫莫耳)。在室溫持續攪拌0.5小時後得到透明溶液。在保持溫度低於40℃之速率下加入9a-1(1.79毫升，15.54毫莫耳)。將混合物在室溫攪拌過夜後得到黃色溶液。用水將反應淬滅並用石油醚(35毫升x4)萃取。將合併的有機層濃縮。並將殘留物用石油醚洗提經由矽膠層析法純化後得到9a-2(2.544克)之無色油。 9a-3之製備
    在乾燥的三頸燒瓶中在氮氣壓下加入Mg(170.1毫克，7.10毫莫耳)、無水THF(10毫升)及少量的碘。加入在THF(2毫升)中1/3的9a-2(1.664克，5.9192毫莫耳)。將混合物加熱至迴流。在此期間，黃色混合物逐漸變成鮮黃色。然後逐滴加入剩餘2/3的9a-2，並將反應混合物再迴流0.5小時。
    在上述混合物中，在0℃緩慢加入DMF(0.504毫升，6.51毫莫耳)。在室溫持續攪拌0.5小時。加入HCl(2M，10毫升)，並將THF蒸發。將殘留物用醋酸乙酯(25毫升x3)萃取。並將合併的有機層用鹽水清洗並在真空濃縮。將殘留物用石油醚至石油醚/醋酸乙酯=20/1洗提經由矽膠層析法純化後得到9a-3(694毫克)之無色油。 9a-5之製備
    在2-(苄氧羰基胺基)-2-(二甲氧基磷醯基)醋酸甲酯9a-4(993毫克，3.00毫莫耳)於DCM(30毫升)的溶液中在室溫下加入DBU(832微升，5.57毫莫耳)。經10分鐘後，加入9a-3(964毫克，3.01毫莫耳)並將所得的混合物在室溫攪拌1小時。將溶液用HCl(1M，10毫升)清洗，並將合併的有機層乾燥及在真空濃縮。將殘留物在矽膠上經由快速層析法純化(用二氯甲烷/醋酸乙酯=10/1洗提)後得到9a-5(1.11克)。 10之製備
    將9a-5(100毫克)於MeOH(50毫升)中的溶液經由20毫克10% Pd/C在大氣壓力下氫化2小時。經由過濾去除觸媒後，將溶劑蒸發而得到10(33毫克)。 培養基配方
    用於製備培養基的水是使用Millipore Elix Analytical Grade Water Purification System製備。
    一般發酵方法
    將BIOT-4585之凍存孢子儲備液(施工方法見實例1)在室溫解凍。經由轉移4.0毫升孢子儲備液至在配備泡沫插件的2升Erlenmeyer燒瓶中的400毫升培養基SM25中而製備植物培養液。在27℃及250 rpm(5.0公分行程)進行培養48小時。將25毫升種子培養液轉移至在配備泡沫插件的2升Erlenmeyer燒瓶中的250毫升生產培養基SGP2+5%HP20中。在24℃及250 rpm(2.5公分行程)培養24小時後，將所要的前驅物(例如2-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯，DL-5-氟-間-酪胺酸(9)或2-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯(10))在1M氫氯酸之2毫升250毫莫耳濃度外消旋性或125毫莫耳濃度對掌異構性純的溶液及DL-六氫吡酸之2毫升250毫莫耳濃度甲醇系溶液添加至各生產燒瓶中而得到最終1毫莫耳濃度之前驅物個別對掌異構物。可以隨意地使用DMSO代替1M氫氯酸。可以隨意地略除DL-六氫吡酸。在24℃及250 rpm(2.5公分行程)持續培養4天。 經由LC-UV及LC-UV-MS分析培養液湯
    加入培養液湯(1毫升)及醋酸乙酯(1毫升)並混合15-30分鐘後離心10分鐘。收集0.4毫升的有機層，蒸發至乾後再度溶解在0.20毫升乙腈中。 HPLC條件：
    C18 Hyperclone BDS C18管柱3u,4.6毫米x 150毫米配備Phenomenex Analytical C18 Security保護管柱(KJ0-4282)
    管柱溫度在50℃
    流速1毫升/分鐘
    監測器UV在240毫微米
    注射20微升等份試樣 溶劑梯度：

    0分鐘：55% B
    1.0分鐘：55% B
    6.5分鐘：100% B
    10.0分鐘：100% B
    10.05分鐘：55% B
    13.0分鐘：55% B
    溶劑A是水+0.1%甲酸
    溶劑B是乙腈+0.1%甲酸
    在這些條件下，SfA在5.5分鐘洗提
    在這些條件下，SfB在6.5分鐘洗提
    在整合的Agilent HP1100 HPLC系統結合在正離子模式操作的Bruker Daltonics Esquire 3000+電灑式質譜儀使用上述層析儀及溶劑進行LCMS。 QC LC-MS方法HPLC條件：
    C18 Hyperclone BDS C18管柱3u,4.6毫米x 150毫米配備Phenomenex Analytical C18 Security保護管柱(KJ0-4282)
    管柱溫度在50℃
    流速1毫升/分鐘
    監測器UV在210、240及254毫微米 溶劑梯度：
    0分鐘：10% B
    2.0分鐘：10% B
    15分鐘：100% B
    17分鐘：100% B
    17.05分鐘：10% B
    20分鐘：10% B
    溶劑A是水+0.1%甲酸
    溶劑B是乙腈+0.1%甲酸 MS條件：
    在開關模式(在正及負之間開關)操作MS，掃描從150至1500 amu。 試管內複製子測試法用於評估HCV抗病毒活性
    對抗基因1型HCV之抗病毒功效可以測試如下：添加測試物件的前一天，將含有HCV基因1b型I389luc-ubi-neo/NS3-3’/5.1複製子(Vrolijk et al.,2003)並在在1.3-1.4之比例下在75平方公分組織培養瓶(Techno Plastic Products)中的細胞生長培養基[DMEM(Cat No.41965039)補充10% FCS、1%非必要胺基酸(11140035)、1%青黴素/鏈黴素(15140148)及2% Geneticin(10131027)；Invitrogen]中生長3-4天的繼代培養Huh5.2細胞收集並在6500個細胞/槽(100微升/槽)之密度下植入96-槽組織培養微量滴定盤(Falcon,Beckton Dickinson用於評估抗代謝效應及CulturPlate,Perkin Elmer用於評估抗病毒效應)之測試培養基(DMEM、10% FCS、1%非必要胺基酸、1%青黴素/鏈黴素)中。將微量滴定盤培養過夜(37℃,5% CO2,95-99%相對濕度)，得到非融合細胞單層。
    製備連續稀釋液；各連續稀釋液是在至少雙重複下進行。測試法建立後，將微量滴定盤培養72小時(37℃,5% CO2,95-99%相對濕度)。
    對於抗代謝效應之評估，將測試培養基吹氣，用75微升在無酚紅的培養基中的5% MTS(Promega)溶液代替並培養1.5小時(37℃,5% CO2,95-99%相對濕度)。在498毫微米的波長測量吸收值(Safire2,Tecan)並將光學密度(OD值)轉化成未經處理的對照組之百分比。
    對於抗病毒效應之評估，將測試培養基吹氣並將細胞單層用PBS清洗。將清洗緩衝液吹氣，加入25微升Glo溶解緩衝液(Cat.N°.E2661,Promega)，然後使溶解在室溫進行5分鐘。隨後，加入50微升螢光酶測試系統(Cat.N°.E1501,Promega)並立即定量螢光酶發光訊號(1000毫秒整合時間/槽，Safire2,Tecan)。將相對發光單元轉化成未經處理的對照組之百分比。
    EC50及EC90(從劑量-反應曲線衍生的值)代表觀察到各50%及90%病毒複製抑制作用之濃度。CC50(從劑量-反應曲線衍生的值)代表細胞的代謝活性降低至未經處理的細胞之50%代謝活性之濃度。表示化合物的醫療窗之選擇指數(SI)是以CC50/EC50計算。
    當觀察到抗複製子效應是高於70%閥值且代謝活性下降不超過30%之特定濃度，該化合物之濃度視為在HCV複製子系統中引出真正的抗病毒效應。 試管內複製子測試法用於評估在基因型1a及2a中的HCV抗病毒活性
    將複製子細胞(基因1a(H77)及2a(JFH-1)型的亞基因複製子)在Dulbecco’s改良的必要培養基(DMEM)、10%牛犢血清(FBS)、1%青黴素-鏈黴素(pen-strep)、1%谷胺醯胺、1%非必要胺基酸、250微克/毫升G418中，在5% CO2的培養器中在37℃生長。全部的細胞培養試劑可購自Mediatech(Herndon,VA)。
    將複製子細胞胰酶消化並在每槽5 x 103個細胞下植入96-槽盤之不含G418的上述培養基中。第二天，將培養基更換成在5%FBS存在下含有連續稀釋的化合物之DMEM。HCV複製子抗病毒測試法檢視化合物在一系列化合物稀釋中的效應。簡要地說，將含有HCV複製子的細胞植入96-槽盤中。測試物件用含有5%FBS之DMEM連續稀釋。將稀釋後的化合物施加至盤中的適當槽內。在37℃培養72小時後處理細胞。用RNeasy 96套組(Qiagen)從各槽萃取細胞內的RNA。根據先前的說明(Vrolijk et al.,2003)，使用TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents(Applied Biosystems,Foster City,CA)及ABI Prism 7900系列偵測系統(Applied Biosystems)經由逆轉錄酶-即時PCR測試法測定HCV RNA的值。使用TaqMan® Ribosomal RNA Control Reagents(Applied Biosystems)測量細胞毒性效應作為細胞數之指標。然後使用HCV RNA及核糖體RNA的值衍生可行的IC50值(50%抑制複製子複製之濃度)。 評估微粒體代謝(微粒體安定性測試法)
    在微粒體中代謝的速率可以測試如下：將小鼠或人類肝臟微粒體用緩衝液C(0.1莫耳濃度磷酸鉀緩衝液，1.0毫莫耳濃度EDTA,pH 7.4)稀釋至濃度為2.5毫克/毫升。然後經由將50微升5微莫耳濃度化合物添加溶液(0.5微升10毫莫耳濃度DMSO儲備溶液在9.5微升ACN中，添加至990微升緩衝液C)添加至50微升微粒體溶液(2.5毫克/毫升)、110微升緩衝液C並充分混合而製備微粒體安定性樣品。然後將全部樣品在37℃預先培養約15分鐘。隨後，經由加入40微升NADPH溶液(12.5毫莫耳濃度)並溫和混合而開始反應。在0、15、30、45及60分鐘取出等份試樣(40微升)並用含內標之ACN(120微升)淬滅。經由離心(4000 rpm，15分鐘)將蛋白質取出並經由LC-MS/MS分析樣品盤之化合物濃度。然後經由標準方法計算半衰期，比較分析物之濃度與最初存在的量。 評估肝細胞安定性
    將先前保存在液態氮中的凍存肝細胞放在37±1℃的搖動水浴中經2分鐘±15秒。然後將肝細胞添加至10X體積預先溫熱的Krebs-Henseleit碳酸氫鹽(KHB)緩衝液(2000毫克/升葡萄糖，無碳酸鈣及碳酸氫鈉，Sigma)，溫和混合並在500 rpm離心3分鐘。離心後，小心取出上清液並加入10X體積預先溫熱的KHB緩衝液將細胞丸粒再度懸浮。將其溫和混合並在500 rpm離心3分鐘。然後取出上清液並丟棄。然後經由細胞計數測定細胞活力及產量，並使用這些值產生適當植入密度之人類肝細胞懸浮液(活細胞系度=2x106個細胞/毫升)。在預先溫熱的KHB緩衝液(1% DMSO)中製備2X劑量溶液(200微莫耳濃度添加溶液：20微升作用物儲備溶液(10毫莫耳濃度)在980微升DMSO中，2X劑量溶液：10微升200微莫耳濃度添加溶液在990微升KHB中(稀釋後2微莫耳濃度))。
    將50微升預先溫熱的2X劑量溶液添加至槽內並加入50微升預先溫熱的肝細胞溶液(2x106個細胞/毫升)並計時開始。然後將盤在37℃培養。完成培養時間(0、15、30、60及120分鐘)後加入100微升含有內標的乙腈至各槽內，溫和混合並加入50微升預先溫熱的肝細胞溶液(2x106個細胞/毫升)。培養結束後，測定細胞活力。將樣品在4000 rpm及4℃離心15分鐘，上清液用超純水稀釋2倍並經由LC-MS/MS分析化合物的量。 評估水溶解度
    水溶解度測試如下：在室溫下的100% DMSO中製備薩菲菌素同系物之10毫莫耳濃度儲備溶液。將三重複的0.01毫升等份試樣在琥珀色小瓶中用0.1莫耳濃度PBS,pH 7.3溶液或100% DMSO調整至0.5毫升。將剩餘的0.2毫莫耳濃度溶液在室溫下在IKA® vibrax VXR搖動機上搖動6小時，隨後將所得的溶液或懸浮液轉移至2毫升Eppendorf試管並在13200 rpm離心30分鐘。然後將等份試樣的上清液經由上述的LCMS分法分析。
    或者是，在PBS,pH 7.4中的溶解度可以測試如下：用在H2O中的50% MeOH將化合物及對照化合物稀釋至40微莫耳濃度、16微莫耳濃度、4微莫耳濃度、1.6微莫耳濃度、0.4微莫耳濃度、0.16微莫耳濃度、0.04微莫耳濃度及0.002微莫耳濃度而產生校正曲線。標準點是在MeOH：PBS 1：1中進一步稀釋1：20。1：20稀釋後的最終濃度是2000毫微莫耳濃度、800毫微莫耳濃度、200毫微莫耳濃度、80毫微莫耳濃度、20毫微莫耳濃度、8毫微莫耳濃度、2毫微莫耳濃度及1毫微莫耳濃度。然後將標準品與相同體積(1：1)含有內標(羥基巨環，6)的ACN混合。將樣本離心(5分鐘，12000 rpm)，然後經由LCMS分析。
    在10毫莫耳濃度下在DMSO中製備測試化合物之儲備溶液。將儲備溶液雙重複在1.5毫升Eppendorf試管中稀釋至PBS,pH 7.4中，目標濃度是100微莫耳濃度且最終DMSO濃度是1%(例如4微升的10毫莫耳濃度DMSO儲備溶液至396微升100毫莫耳濃度磷酸鹽緩衝液中)。然後將樣品試管在室溫溫和搖動4小時。將樣本離心(10分鐘，15000 rpm)使不溶解的粒子沈澱。將上清液轉移至新的試管並用PBS稀釋(個別測試物件之稀釋因子是經由化合物在應用分析儀器上的訊號值證實)。然後將稀釋的樣本與相同體積(1：1)的MeOH混合。樣本最後與相同體積(1：1)含有內標(羥基巨環，6)的ACN混合用於LCMS分析。 評估細胞滲透性
    細胞滲透性測試如下：將測試化合物在DMSO中溶解至10毫莫耳濃度後在緩衝液中進一步稀釋而得到最終10微莫耳濃度之給藥濃度。也加入螢光標示劑螢光黃以監視細胞膜完整性。然後將測試化合物施加至Caco-2細胞單層之頂部表面並測量化合物滲透至基底部份。這是在逆向(基底至頂部)進行以調查活性輸送。使用LC-MS/MS定量測試化合物及標準對照化合物(例如普萘洛爾(Propanolol)及醋丁洛爾(Acebutolol))之值。 活體內評估藥物動力學
    活體內測試法也可以用於測量化合物之生物利用度。通常，化合物是經由靜脈(i.v.)及口服(p.o.)投藥至測試動物(例如小鼠或大鼠)並在固定間隔抽取血液樣本以檢視藥物在各時間之血漿濃度變化。血漿濃度隨著時間之歷程可以用於計算化合物之絕對生物利用度作為使用標準模式之百分比。典型的方案之實例說明如下。
    經由靜脈或口服將1、10或100毫克/公斤的本發明化合物或母化合物給藥至小鼠。在5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、420及2880分鐘抽取血液樣本並經由HPLC測定本發明化合物或母化合物在樣本中的濃度。然後使用血漿濃度之時間-歷程得到關鍵參數例如血漿濃度-時間曲線下的面積(ACU-其係與到達全身系統未經變化的藥物之總量成正比)、最大(峰值)血漿藥物濃度、最大血漿藥物濃度出現的時間(峰值時間)、用於精確測定生物利用度之其他因子包括：化合物之終端半衰期、總身體清除、分布之穩態體積及F%。隨後經由非房室或房室方法分析這些參數而得到計算的百分比生物利用度，此種方法之實例見Egorin et al.2002及其中的參考文獻。 活體內評估口服及靜脈藥物動力學(特定方法)
    分析血液內的薩菲菌素同系物。化合物在5%乙醇/5%氫化蓖麻油EL/90%鹽水中調製供口服及靜脈投藥。3組雄性CD1小鼠靜脈投藥1毫克/公斤或口服投藥5毫克/公斤。給藥前及在0.25、0.5、2、8及24小時經由大隱靜脈抽取血液樣本(40微升)，並用等量的dH2O稀釋後立即放在乾冰上。將樣本儲存在-70℃直到分析。本發明化合物或母化合物在樣本中的濃度是經由LCMS分析如下：將20微升血液：H2O(1：1,v/v)/PK樣本在100毫微克/毫升添加20微升內標(羥基巨環，6)、20微升工作溶液/MeOH及150微升ACN，在1500 rpm攪拌1分鐘，並在12000 rpm離心5分鐘。將上清液注射至LC-MS/MS。繪製血液濃度之時間歷程並用於得到在整個血液濃度-時間曲線下的面積(ACU-其係與到達全身系統未經變化的藥物之總量成正比)。使用這些值得到可能的PK參數。 試管內評估細胞毒性
    將得自ATCC之Huh-7及HepG2細胞在含有10%牛犢血清(FBS)、1%青黴素-鏈黴素(pen-strep)及1%谷胺醯胺之Dulbecco’s改良的必要培養基(DMEM)中生長；而CEM細胞(得自ATCC之人類T-細胞白血病細胞)是在含有10% FBS、1% pen-strep及1%谷胺醯胺之RPMI 1640培養基中生長。從得自至少兩個正常篩選的供體之全血分離新鮮的人類PBMCs。簡要地說，經由低速離心及再度懸浮在PBS將末梢血液細胞丸粒化/清洗2-3次以移除參雜的血小板。然後將清洗後的血液細胞用Dulbecco’s磷酸鹽緩衝化的鹽水(D-PBS)稀釋1：1並在50毫升離心試管內的14毫升淋巴細胞分離培養基(LSM；經由Mediatech,Inc.細胞生長；密度1.078+/-0.002克/毫升；Cat.# 85-072-CL)層化後在600 X g離心30分鐘。從所得的界面溫和吹氣分帶的PBMCs且隨後用PBS經由低速離心清洗2次。最後清洗後，經由錐藍排除法(trypan blue exclusion)計數細胞並在1 x 107個細胞/毫升再度懸浮在補充15%牛犢血清(FBS)、2毫莫耳濃度L-谷胺醯胺、4微克/毫升PHA-P之RPMI 1640中。使這些細胞在37℃培養48-72小時。培養後，將PBMCs離心並再度懸浮在補充15% FBS、2毫莫耳濃度L-谷胺醯胺、100 U/毫升青黴素、100微克/毫升鏈黴素、10微克/毫升慶大黴素及20 U/毫升重組人類IL-2之RPMI 1640中。
    化合物細胞毒性是經由測試各化合物在三重複下對抗上述細胞的半-對數濃度而評估。只含培養基的細胞作為細胞對照組(CC)。Huh-7及HepG2細胞在每槽5x103之濃度植入96-槽培養盤中。第二天，將培養基吹氣，並加入100微升含5% FBS的對應培養基。在微量滴定試管中在2X濃度下製備藥物稀釋並將100微升各濃度放入在標準格式之適當槽內。經72小時後，細胞進行細胞毒性評估。
    將PBMCs在新鮮培養基中稀釋並在100升體積在5x104個細胞/槽下放入96槽圓底微量培養盤之內槽中。同樣地，將CEM細胞在1x104個細胞/槽下放入。然後，將測試藥物之100微升2X製劑加入在標準格式之適當槽內。將培養液保持6至7天後進行細胞毒性測定。
    細胞毒性是使用CytoTox-ONETM均勻細胞膜完整性測試套組(Promega)測定。該測試法測量從受損細胞膜的細胞在螢光均勻格式下釋出的乳酸脫氫酶(LDH)。使用偶合的酶解測試法測量釋放至培養基內的LDH其導致將刃天青素轉化成螢光瑞鹵靈(resorufin)產物。產生的螢光量是與溶解的細胞數量成正比。將各化合物序列稀釋的濃度施加至細胞而得到可行的TC50(降低細胞活力50%的藥物毒性濃度)及TC90(降低細胞活力90%的藥物毒性濃度)值。 試管內評估MDR1及MRP2轉運體之抑制作用
    評估MDR1(P-糖蛋白1)及MRP2轉運體之抑制作用及活化作用，可以使用Solvo Biotechnology Inc.之試管內ATPase測試法(Glavinas et al.,2003)。化合物(在0.1、1、10及100微莫耳濃度)與MDR1或MRP2細胞膜媒劑在無或有釩酸鹽存在下培養以研究潛在的ATPase活化作用。此外，在維拉帕米/柳氮磺胺吡啶(verapamil/sulfasalazine)存在下進行類似的培養以便偵測轉運體ATPase活性之可能抑制作用。ATPase活性是經由分光光度計定量無機磷酸鹽而測量。從ATPase活性中釩酸鹽敏性增加而計算活化作用。經由維拉帕米/柳氮磺胺吡啶居間影響的ATPase活性降低而測定抑制作用。 使用MDCK細胞試管內評估Pgp轉運體之抑制作用
    評估P-糖蛋白(Pgp/MDR1)轉運體之抑制作用，是使用從Cyprotex之試管內ATPase測試法。使用從NIH(Rockville,MD,USA)得到的MDR1-MDCK細胞。培養後，經由使用在pH 7.4及37℃的緩衝液清洗基底及頂部表面兩次而製備單層。然後將細胞用pH 7.4緩衝液在頂部及基底部份在37℃及5% CO2且相對濕度是95%培養40分鐘以安定生理參數。對於頂部對基底的研究(A-B)，將pH 7.4的緩衝液從頂部移除並換成洛哌丁胺(loperamide)給藥溶液後放入「伴隨(companion)」盤內。該溶液是經由用緩衝液稀釋在DMSO中的洛哌丁胺，得到最終洛哌丁胺濃度是5微莫耳濃度(最終DMSO濃度調整至1%)而製備。在給藥溶液中也加入螢光完整性標示劑螢光黃。在有或無測試化合物(施加至頂部及基底部份)存在下進行實驗。對於基底對頂部(B-A)的研究，將P-糖蛋白作用物、洛哌丁胺(最終濃度=5微莫耳濃度)放入基底部份。在有或無測試化合物(施加至頂部及基底部份)存在下進行實驗。在5% CO2且相對濕度是95%在37℃進行培養60分鐘。培養後，將伴隨盤取出並稀釋頂部及底部樣本供經由LC-MS/MS分析。進行單次測定各測試化合物濃度。在各盤中，也篩選正對照組抑制劑。在0.1、0.3、1、3、10、30及50微莫耳濃度評估測試化合物。使用螢光分析法經由偵測螢光黃滲透而檢查單曾在整個實驗中的完整性。分析後，計算IC50(也就是(測試藥物)達到半最大抑制效應的抑制劑濃度)。 試管內評估攝取轉運體之抑制作用
    為了評估OAT1B1及OAT1B3攝取轉運體之抑制作用，是使用從Solvo Biotechnology Inc.之試管內攝取轉運體測試法。在穩定表達人類SLC轉運體OAT1B1及OAT1B3的CHO細胞上在0.068、0.2、0.62、1.8、5.5、16.7及50微莫耳濃度進行測試物件(TA)之攝取實驗。使用親代細胞株CHO-K作為負對照組。將細胞(1×105在200微升補充5毫莫耳濃度丁酸鈉的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium及Ham’s F-12 DMEM(F-12,Lonza,New Jersey,US)之1：1混合物中)放入標準96-槽組織培養盤中並在實驗前24小時在37℃及5% CO2及95%空氣之氣壓下培養。實驗前經由真空吸氣吹氣培養基。用2x100微升Krebs-Henseleit緩衝液pH 7.3(從Sigma chemicals,Sigma-Aldrich,St Louis,MO製備)清洗細胞。在37℃在50微升分別含有探討的作用物及TA或溶劑之Krebs-Henseleit緩衝液(pH 7.3)中進行攝取實驗。各槽中的有機溶劑濃度相同，且不超過1% v/v。OATP1B1測試法之探討的作用物是E3S(0.1微莫耳濃度)且OATP1B3測試法是Fluo-3(10微莫耳濃度)。在cpm測定探討的作用物在各槽內轉移的量。從下式計算相對活性：活性%=(A-B)/(C-D)x100其中A=作用物在TA存在下在轉染細胞中轉移的量，B=作用物在TA存在下在親代細胞中轉移的量，C=作用物在溶劑存在下在轉染細胞中轉移的量且D=作用物在溶劑存在下在親代細胞中轉移的量。IC50定義為50%抑制輸送探討的作用物所需的TA濃度。IC50是衍生自三個參數對數公式；經由非線性回歸套入相對活性對TA濃度繪圖的曲線。 試管內評估排除(efflux)轉運體之抑制作用
    為了評估MRP2、MRP3及BSEP外排轉運體之抑制作用，是使用從Solvo Biotechnology Inc.之試管內囊泡轉運體測試法。測試物件(TAs)(在0.068、0.2、0.62、1.8、5.5、16.7及50為莫耳濃度)與排足轉運體細胞膜媒劑(Solvo Biotechnology Inc.)在無或有4毫莫耳濃度ATP存在下培養以分辨轉運體居間影響的攝取及TA’s被動擴散至媒劑。在MRP2及MRP3轉運體之情形下，在2毫莫耳濃度穀胱甘肽存在下進行反應。將反應混合物在37℃預先培養10分鐘。經由加入25微升12毫莫耳濃度MgATP(在測試法中4毫莫耳濃度最終濃度)或背景對照組之測試緩衝液而開始反應。經由加入200微升冰冷的清洗緩衝液而停止反應並立即在96-槽格式(過濾板)之玻璃纖維濾紙上過濾。將閃爍緩衝液添加至清洗並乾燥的過濾板中且隨後計數閃爍。BSEP媒劑之探討的作用物是牛磺膽酸鹽(2微莫耳濃度)且MRP2及MRP3媒劑是E217 β G(1微莫耳濃度)。在cpm單位下測定探討的作用物在全部槽的轉移量。相對活性是用下式計算：活性%=(q-B)/(C-D)x100，其中A=作用物在TA及ATP存在下轉移的量，B=作用物在TA存在下轉移的量，C=作用物在溶劑及ATP存在下轉移的量且D=作用物在溶劑存在下轉移的量。IC50定義為50%抑制輸送探討的作用物所需的TA濃度。IC50是衍生自三個參數對數公式；經由非線性回歸套入相對活性對TA濃度繪圖的曲線。 試管內測試法用於評估HIV抗病毒活性
    對抗HIV之抗病毒功效可以測試如下：根據先前的敘述(Bobardt et al.,2008)分離血液衍生的CD4+T-淋巴細胞及巨噬細胞。簡要地說，人類PBMCs是從新鮮血液經由在Ficoll-Hypaque(30分鐘，800克，25℃)上分帶(banding)而純化。原始人類CD4+T細胞是從PBMCs用抗-CD4 Dynabeads經由正選擇而純化且隨後使用Detachabead釋放。細胞在補充10% FCS、MEM胺基酸、L-穀胺醯胺、MEM維他命、丙酮酸鈉、及青黴素與鏈黴素之RPMI培養基1640(Invitrogen)中培養且隨後用細菌超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB；100毫微克/毫升)及從另一供應商之殺死絲裂黴素的PMBC(10：1 PMBC：CD4細胞比例)活化。刺激3天後，將細胞1：2分在含有1L-2(200單位/毫升最終濃度)之培養基中。然後每2天1：2分在1L-2培養基中並在刺激7天後轉染HIV。為了產生原始人類巨噬細胞，從人類PBMCs經由負選擇法純化單核細胞並在106/毫升之細胞濃度下在補充10% FCS、MEM胺基酸、L-穀胺醯胺、MEM維他命、丙酮酸鈉、及青黴素(100單位/毫升)、鏈黴素(100單位/毫升)與50毫微克/毫升重組的人類粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)之DMEM中培養並保持在37℃及補充5% CO2之濕化氣壓下。為了得到單核細胞衍生的巨噬細胞，使細胞黏附至塑膠並培養6天使分裂。
    CD4+HeLa細胞、Jurkat細胞、活化的CD4+末梢血液T-淋巴細胞及巨噬細胞(500,000個細胞/100微升)用pNL4.3-GFP(X4病毒)或pNL4.3-BaL-GFP(R5病毒)(100毫微克之p24)在增加濃度的測試物件存在下培養。經48小時後，經由FACS分析GFP-正細胞之百分比而計分感染並計算EC50。 試管內測試法用於評估HBV抗病毒活性
    對抗HBV之抗病毒功效可以測試如下：將HepG2 2.2 15細胞放入96-槽微量滴定盤內。經16-24小時後，將HepG2 2.2 15的合流單層清洗並將培養基在三重複下換成含有不同濃度測試化合物(例如六半-對數濃度)之完整培養基。經3天後，將培養基換成含有適當稀釋的測試化合物之新鮮培養基。最初投藥測試化合物經6天後，收集細胞培養液的上清液，用蛋白酶處理且隨後在即時定量TaqMan qPCR測試法中使用。從淬滅的螢光探討分子之外切除降解，導致雜交而擴大的HBV DNA，經由監測螢光訊號之增加而即時偵測PCR-擴大的HBV DNA。對於各PCR擴大作用，同時使用純化的HBV DNA之稀釋而產生標準曲線。從HBV DNA值(IC50)的下降計算抗病毒活性。然後使用染料攝取測試法測量細胞活力，其用於計算毒性(TC50)。理論指數(TI)以TC50/IC50計算。 試管內混合的淋巴細胞反應(MLR)測試法用於評估免疫抑制活性
    免疫抑制活性測試如下：經由使用histopaque離心，從兩個正常不相關的自願提供者(A&B)之血液純化末梢血液單核細胞(PBMC)數。計數細胞並在每槽1x105個細胞下放入96槽培養盤內含有補充物及2%人類AB血清之RPMI培養基中。
    培養條件包括：在有或無測試化合物存在下，細胞數A&B單獨及混合數量之細胞A&B，各在6個不同濃度。在劑量範圍從10微莫耳濃度至0.0001微莫耳濃度在1-對數增量下測試化合物。對照組槽含有相當濃度存在於測試化合物槽之媒劑(0.5% DMSO)。在三重複下在96槽盤中建立培養並在37℃在5% CO2之濕化氣壓下培養。在測試法建立6天後加入3H-胸苷並在24小時後收集。然後比較在不同培養條件下的複製程度。
    各稀釋的測試化合物在MLR中抑制複製之能力是以百分比抑制作用計算。此使得估計IC50(測試化合物導致每分鐘的計數降低50%之濃度)。為了計算IC50，將X軸轉化成對數尺度。使用非線性回歸以套入平均數據點。選擇S形變化斜率。 Cyp-NS5A相互作用之ELISA分析
    此測試法是用於測量Cyp-NS5A複合物之破壞，其可以用於顯示與親環素D相互作用之功效。簡要地說，重組的GST、GST-CypD及Con1 NS5A-His蛋白質之生產及純化是如先前的說明(Chatterji et al.,2010)進行。將Nunc MaxiSorb 8-槽帶狀板在4℃塗覆GST或GST-CypD經16小時並封鎖。在4℃將在50微升黏著緩衝液(20毫莫耳濃度Tris pH 7.9、0.5莫耳濃度NaCl、10%甘油、10毫莫耳濃度DTT及1% NP-40)中的重組的NS5A-His(1毫微克/毫升)添加至槽內經16小時。隨後使用小鼠抗-His抗體(1微克/毫升)(anti-6xHis,Clontech)及兔子抗-小鼠-山葵過氧化酶磷酸酶(HRP)抗體(1：1000稀釋)偵測捕集的NS5A-His。全部實驗是使用兩種不同批次的重組CypD集NS5A蛋白質進行兩次。 親環素抑制作用之抗-PPIAse分析
    一種分析親環素相互作用之替代方法說明如下：經由GST-CypA或D之凝血酶解離而產生的重組CypA或D之PPIase活性，是經由下面N-琥珀醯基-Ala-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺被胰凝乳蛋白酶水解之速率測定。胰凝乳蛋白酶只水解反式的肽，且順式之水解，其濃度是經由使用溶解在含有470毫莫耳濃度LiCl之三氟乙醇之儲備液而最大化，是受限於順-反異構化之速率。CypA或D與選擇的測試物件用從0.1至20毫微莫耳濃度之藥物濃度範圍在5℃平衡1小時。經由加入肽而開始反應，且在每秒10個數據點以分光光度法監測吸收度之變化。從CypA或D存在下的速率減除水解空白速率(無CypA或D)。經由吸收度改變之時間歷程的一階回歸分析，分析酶解反應之最初速率。 實例1-建構鏈黴菌A92-308110(DSM9954)之sfaA缺失突變體 1.1建構SfaA缺失構築體
    經由使用EcoRV及Stul切割將包含sfaA(核苷酸位置14396-21362，NCBI序列登錄編號FJ809786)之黏粒TL3006(SEQ ID NO.3)之~7kb EcoRV-Stul段片切除並將所得分離段片直接接合至先前用EcoRV切割並用蝦鹼性磷酸酶(Roche)處理之pKC1139。此質體稱為pSGK268。
    使用Gene Bridges供應的Red/ET重組套組(目錄編號K006)進行包含在此選殖內的sfaA基因之支架消除。
    (SEQ ID NO.1)SfaA17161f 5’-CGCTCTGTGGCGCCTGGTTTCCAAGCGGCTCGCGGACCGGCACCGGCACATGCATAATTAACCCTCACTAAAGGGCG-3’
    (SEQ ID NO.2)SfaA17825r 5’-TGGATGTATCGTCGCAGGACGCCCAGAATTCACCTGCGACGTCCTCCAGATGCATTAATACGACTCACTATAGGGCTC-3’
    使用兩種寡核苷酸SfaA17161f及SfaA17825r在使用KOD DNA聚合酶的套組中供應的FRT-PGK-gb2-neo-FRT模板DNA擴大新黴素標記。經由電泳分離所得~1.7kb擴大的產物並用QiaEX樹脂從膠體純化。
    使用標準技術將質體pSGK268轉化至大腸桿菌DH10B中並在含安普黴素(50微克/毫升)的板上選擇。基本上是在Gene Bridges套組方案之後進行加入缺失構築體。單一菌落在2TY安普黴素(50微克/毫升)中生長過夜並用pRedET(tet)質體轉化且在30℃在安普黴素(50微克/毫升)及四環素(3微克/毫升)上選擇。使用單一菌落在30℃在3毫升2TY安普黴素(50微克/毫升)及四環素(3微克/毫升)中製備此菌株之過夜培養物。使用0.5毫升此培養物在30℃接種10毫升2TY安普黴素(50微克/毫升)及四環素(3微克/毫升)並生長至OD600nm~0.5。將1.4毫升此培養物轉移至各2個eppendorf試管並將50微升10阿拉伯糖添加至一個試管使引發表達Red/ET重組的蛋白質。將試管在37℃搖動~1小時。在桌上型離心機上將引發及無引發的細胞粒化並用冰冷的無菌水清洗兩次；每次再度懸浮並將細胞離心成粒。將所得的粒狀物懸浮在約30-40微升水中並在冰上保存。將先前分離的1.7kb破壞段片添加至引發及無引發的試管內並轉移至冰上1毫米Biorad電試管內。將樣本電穿孔化(在1.8kV的Biorad Micropulser，產生恆定時間~4毫秒)並加入1毫升2TY(無抗生素)且混合使細胞從試管移除。將細胞在37℃及搖動(1100 rpm，eppendorf小型熱混合機)下培養~3小時後放入含有安普黴素(50微克/毫升)及卡那黴素(25微克/毫升)的2TY板上且在37℃培養過夜。將從引發的樣本板之菌落挑至含有卡那黴素(50微克/毫升)的2TY板上純化並證實加入卡那黴素抵抗性匣。使用在各菌落上的PCR證實加入匣。從這些培養物製備質體並消化以證實預期的質體pSGK270。然後用NsiI消化質體以移除標示劑段片，且剩餘物重新黏合而得到sfaA框內缺失構築體pSGK271。 1.2鏈黴菌A92-308110(DSM9954)之接合作用及加入SfaA缺失
    使用標準技術將質體pSGK271轉形至大腸桿菌ET12567 pUZ8002中並在含有安普黴素(50微克/毫升)、卡那黴素(25微克/毫升)及氯黴素(10微克/毫升)的2TY平板上篩選。將所得的菌株接種至含有安普黴素(50微克/毫升)、卡那黴素(25微克/毫升)及氯黴素(10微克/毫升)的3毫升液態2TY中並在37℃及250 rpm下培養過夜。使用0.8毫升此培養物接種在50毫升Falcon試管中含有安普黴素(50微克/毫升)、卡那黴素(25微克/毫升)及氯黴素(10微克/毫升)的10毫升液態2TY中並在37℃及250 rpm下培養直到OD600nm~0.5。將所得的培養物在4℃及3500 rpm離心10分鐘，用2TY培養基清洗兩次，每次清洗後使用離心將細胞粒化。將所得的粒狀物再度懸浮在0.5毫升2TY中並在使用前在冰上保存。此過程與下述完成製備鏈黴菌孢子的時間配合。
    經由懸浮在~3毫升20%甘油中，從1-2星期齡的合流板收取鏈黴菌A92-308110(DSM9954)(Biot-4370)之孢子。將孢子離心(5000 rpm，10分鐘室溫)並用50毫莫耳濃度TES緩衝液清洗兩次後再懸浮於1毫升50毫莫耳濃度TES緩衝液中並分開至2個eppendorf試管內。將這些試管在50℃的熱水浴中加熱震動10分鐘後加入0.5毫升2TY並在37℃的小型Eppendorf熱混合機中培養4-5小時。
    將製備的大腸桿菌ET12567 pUZ8002 pSGK271及Biot-4370在1：1(250微升各菌株)及1：3(100微升大腸桿菌)之比例下混合並立即分散在R6板上且轉移至37℃培養箱內。約2小時培養後，將這些平板覆蓋含有奈定酸(nalidixic acid)的2毫升無菌水而得到最終板內濃度是25微克/升。將平板放回37℃培養箱過夜後覆蓋含有安普黴素的2毫升無菌水而得到最終板內濃度是20-25微克/升。在~4-7天後出現的前接合體貼合至含有安普黴素(25微克/毫升)及奈定酸(25微克/毫升)的ISP4培養基並在37℃培養。一旦觀察到適當菌絲生長時，將菌株再度貼合至在37℃含有安普黴素(25微克/毫升)的ISP4培養基並容許形成孢子。然後經由貼合至ISP4(無抗生素)並在37℃培養3-4天，將菌株次培養3次(使促進移除溫度敏性的質體)。將菌株最後貼合至ISP4並在28℃培養使完全形成孢子(5-7天)。收取孢子並連續稀釋在28℃的平板上使篩選單一菌落。將形成孢子的單一菌落雙重覆貼合至有或無安普黴素(25微克/毫升)的ISP4平板以證實失去質體並容許生長~7天後測試薩菲菌素之生產。 1.3篩選菌株用於在falcon試管中生產薩菲菌素
    使用充分形成孢子的菌株之單一~7毫米瓊脂插栓接種7毫升無菌SM25-3培養基並在27℃及200 rpm下在2”拋扔搖動器中培養。生長48小時後，將0.7毫升此培養物轉移至含有7毫升SGP2培養基及5HP20樹脂的無菌falcon試管內。培養物在24℃及300 rpm下在1吋拋扔搖動的培養箱中生長5天後收集。取出0.8毫升細菌培養物並等份試樣至2毫升eppendorf試管內，等份試樣化前確保足夠分散的樹脂在整個培養物中。加入0.8毫升乙腈及15微升甲酸並將試管混合約30分鐘。經由離心使混合物澄清化並將170微升的萃取液取出至HPLC小瓶內並經由HPLC分析。 1.4分析菌株用於反轉至野生型或sfaA表現型
    經由HPLC分析菌株的萃取物。產生薩菲菌素A及B之菌株不再分析因為這些經反轉成野生型。缺少薩菲菌素A及B生產之菌株顯現小級別(~1-2毫克/升)之波峰滯留時間6.5分鐘，其顯示類似薩菲菌素發色團。經由LCMS分析指出此波峰具有m/z 1073，-16單元從薩菲菌素預期的m/z。其係假設此波峰是因為在缺少間-羥基酪胺酸下摻入苯基丙胺酸。
    顯示失去薩菲菌素生產的八種菌株隨後再度生長以評估是否潛在的sfaA突變可以化學性補償使突變合成進展成新穎的薩菲菌素。菌株在SM25-3種子培養基中生長48小時後轉移至含5%樹脂的SGP2生產培養基。再經24小時的生長後，菌株再三重複下餵食2毫莫耳濃度間-羥基酪胺酸(添加100微升在1M HCl中的0.16莫耳濃度溶液)或2毫莫耳濃度L-苯基丙胺酸且未經餵食的菌株作為對照組使用。菌株也餵食哌啶甲酸(2毫莫耳濃度在甲醇中)以增加產物產量。再經4天生長後收取菌株並萃取及經由HPLC分析。間-羥基酪胺酸顯示完全補償sfaA突變且加入L-苯基丙胺酸增量-16 amu化合物。選擇菌株Biot-4585作為sfaA缺失突變之進一步研究。 實例2-其他方法用於建構sfaA缺失構築體
    其他方法可以用於產生sfaA缺失突變體。實例包括sfaA插入失活突變體(例如從WO2010/034243之實例12)。此菌株是根據WO2010/034243之說明而產生，且得到的菌株稱為BIOT-4452。
    在產生缺失sfaA的替代方法中，使用兩種寡核苷酸15209F 5’-CAGAGAATTCGCGGTACGGGGCGGACGACAAGGTGTC-3’(SEQ ID NO.4)及17219R 5’-GCGCATGCATGTGCCGGTGCCGGTCCGCGAGCCGCTTGG-3’(SEQ ID NO.5)以擴增使用黏粒TL3006(SEQ ID NO.3)作為樣板及KOD DNA聚合酶的同源物之上游區域。擴增的產物用T4聚核苷酸激酶(NEB)處理並選殖至用蝦鹼性磷酸酶(Roche)處理而去磷酸化之pUC18。所得的構築體經由限制酶切割分析並完全定序以確保產生所要的序列且在聚合酶擴大期間沒有產生誤差。此構築體用EcoRI及NsiI切割並經由凝膠電泳分析產物。將含有所要序列的頻帶(也就是上游同源物~2kb)從膠體切除並使用標準方法(QiaEX樹脂)純化。使用第二種序列之寡核苷酸：17766F 5’-CCTCATGCATCTGGAGGACGTCGCAGGTGAATTCTGGGCG-3’(SEQ ID NO.6)及19763R 5’-GGGCAAGCTTCTCCTGGCTGAGCTTGAACATCG-3’(SEQ ID NO.7)以擴增使用黏粒TL3006(SEQ ID NO.3)作為樣板及KOD DNA聚合酶的同源物之下游區域。擴大的產物用T4聚核苷酸激酶(NEB)處理並選殖至用蝦鹼性磷酸酶(Roche)處理而去磷酸化之pUC18。所得的構築體經由限制酶切割分析並完全定序以確保產生所要的序列且在聚合酶擴大期間沒有產生誤差。此構築體用HindIII及NsiI消化並經由凝膠電泳分析產物。將含有所要序列的頻帶(也就是下游同源物~2kb)從膠體切除並使用標準方法(QiaEX樹脂)純化。載體pKC1139用EcoRI及HindIII消化且大載體段片經由凝膠電泳分離並經由標準方法(QiaEX樹脂)純化。分離的上游及下游同源物段片隨後在三向接合下選殖至pKC1139之此段片以產生所要的sfaA缺失構築體。
    在產生sfaA缺失構築體的另一個替代方法中，使用商業化供應的基因合成(也就是Genscript或其他販售者)產生含有所要序列(SEQ ID NO.8)的構築體。此購買的構築體用BamHI及XbaI消化以切下有價值的序列並經由凝膠電泳分析產物。將含有所要序列的頻帶(~4kb)從膠體切除並使用標準方法純化。載體pKC1139用BamHI及XbaI切割且大片段經由凝膠電泳分離並經由標準方法純化。然後將兩個分離的段片接合在一起而產生所要的sfaA缺失構築體。
    使用實例1.2說明的方法經由二次交叉之共軛及選擇，將這些替代的sfaA缺失構築體加入鏈黴菌A92-308110(DSM9954)。在此方法建構的菌種之生長及分析也根據實例1.2說明的方法進行。 實例3-sfaA缺失突變體之陣列餵食
    在MAM、ISP4、ISP3或ISP2培養基上生長後，製備在sfaA(BIOT-4452或BIOT-4585)中打亂的突變體之孢子儲備液，並保存在蒸餾水中的20% w/v甘油中且儲存在-80℃。經由將孢子儲備液(1% v/v)接種至含有泡綿插件的50毫升離心試管之7毫升種子培養基(SM25培養基)而製備植物培養物(種子培養物)。將培養管在27℃、250 rpm(5公分行程)培養48小時。從種子培養物10%(v/v)轉移至含有泡綿插件的50毫升離心試管之7毫升生長培養基SGP-2。在24℃及300 rpm(2.5公分行程)進行培養。為了生產薩菲菌素突變合成的同系物，將飼料化合物(突變合成元)之0.05毫升0.32莫耳濃度溶液(在1N HCl中)在培養後24小時添加至各試管內而得到最終濃度2毫莫耳濃度。另外，在24小時將0.05毫升六氫吡嗪酸(在甲醇中)的0.32莫耳濃度溶液添加至各試管而得到最終濃度是2毫莫耳濃度。餵食後繼續培養4天。
    經由將0.8毫升整個培養液轉移至2毫升封蓋的eppendorf試管內而萃取樣本。加入0.8毫升乙腈，以及0.015毫升甲酸。然後將混合物在搖動器上搖動30分鐘。將試管在13000 rpm離心10分鐘並取出0.15毫升上清液供分析。根據通則方法之說明而分析萃取物。
    表1顯示在此方式餵食之突變元，以及觀察到的LCMS H+及Na+加成物、薩菲菌素突變合成的產物之預期分子量及滯留時間。列出相對於薩菲菌素A同系物之主要波峰。在全部情形中，也見到薩菲菌素B同系物(質量-18)之LCMS波峰。
    實例4-分離63-氟薩菲菌素A、中間化合物14
    使用2-胺基-3-(3-氟-5-羥基苯基)丙酸甲酯及DL-六氫吡嗪酸作為前驅物，兩者在26小時加入，根據通則方法之說明而進行發酵。
    收取後將培養液集中並用甲酸調整至約pH 3並離心(3300g)經25分鐘使細胞與樹脂從澄清的培養液分離。當測試證明低於5%的標靶化合物存在時，將澄清的培養液丟棄。使用磁鐵攪拌器將細胞及樹脂與2倍體積乙腈攪拌1小時。經由離心或在重力下使其沈澱而回收乙腈萃取物。然後在相同條件下進行細胞及樹脂的第二次乙腈萃取。將合併的乙腈萃取液在減壓下濃縮成殘留的水性體積後調整至pH6。將此用醋酸乙酯萃取兩次並將合併的有機層在減壓下乾燥後得到最後粗物質(1.3克)。
    將粗萃取物(1.3克)溶解在醋酸乙酯(2毫升)中並填入用醋酸乙酯500毫升)調適之矽膠管柱(10x2公分)中。將管柱用醋酸乙酯洗提且隨後逐步增加丙酮(10%、20%、30%等，在醋酸乙酯中)。收集約250毫升的洗提液且標靶化合物經由分析級LC證實、合併並乾燥。將此物質(278毫克)溶解在甲醇(1.8毫升)並經由製備級HPLC純化。使用Waters Xterra MSC18管柱(10微米，19公分x250毫米)，在21毫升/分鐘抽取溶劑。溶劑A是水且溶劑B是乙腈。注射後將管柱在50% B的相同溶劑成份操作6分鐘，隨後在30分鐘內梯度至100% B。純的洗提份經由HPLC-UV鑑定並合併。將這些洗提份在減壓下乾燥後得到標靶化合物之灰色無定形固體(20毫克)。 實例5-合成(2-(1,2--2-基)-2-氧雜乙基)磷酸二乙酯
    在21-1(ChemCollect,Germany)(100毫克，0.81毫莫耳)、Et3N(246毫克，2.43毫莫耳)於無水DCM(5毫升)的溶液中逐滴加入氯乙醯氯(138毫克，1.22毫莫耳)。將反應混合物在室溫攪拌3小時，倒入冰水中，並用醋酸乙酯萃取。將有機層用鹽水清洗並經由Na2SO4乾燥，過濾，在真空濃縮。將殘留物(21-2)不再有任何純化而用在下一個步驟(123毫克，90%產量)。
    將21-2(123毫克，0.75毫莫耳)及亞磷酸三乙酯(250毫克，1.50毫莫耳)之混合物在140℃攪拌6小時。將反應混合物冷卻至室溫並經由快速層析法純化而得到21。 合成(2-(1,2--2-基)-2-氧雜乙基)磷酸二乙酯21之替代合成
    製備21a-2之通則方法
    在t-BuOK(84.0克，0.75莫耳)於四氫呋喃(2.0升)的溶液中在室溫逐份加入21a-1(50.0克，0.38莫耳)，並將混合物在室溫攪拌1小時。在室溫逐滴加入1,4-二溴丁烷(81.2克，0.38莫耳)。然後將混合物在80℃攪拌16小時。冷卻後，加入水(2000毫升)，將混合物用醋酸乙酯(2x1000毫升)萃取。將合併的有機層經由無水Na2SO4乾燥16小時，過濾並濃縮後，將殘留物經由矽膠管柱層析法(洗提液：石油醚：醋酸乙酯=100：1至10：1)而得到21a-2(57克)之無色油。 製備21a-3之通則方法
    在21a-2(55克，0.29莫耳)於第三丁基甲基醚TBME(80毫升)的溶液中在室溫加入4N HCl溶液(600毫升，在TBME中)，將混合物在室溫攪拌3小時。將沈澱的固體過濾並用TBME(50毫升)清洗後得到21a-3(30克)之白色固體。 製備21之通則方法
    在21a-4(35克，0.18莫耳)、羥基苯並三唑(HOBT)(29克，0.21莫耳)及Et3N(71毫升，0.51莫耳)於無水二氯甲烷(550毫升)的攪拌溶液中在0℃逐份加入1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺(EDCl)(41克，0.21莫耳)。將反應混合物在0℃攪拌0.5小時，然後在0℃加入21a-3(24克，0.20莫耳)並攪拌16小時。然後TLC(石油醚：醋酸乙酯：3/1)顯示反應完成。此時將反應混合物緩慢倒入水(500毫升)中並激烈攪拌。將混合物用二氯甲烷(2x200毫升)萃取。將合併的有機層用鹽水(2x100毫升)清洗，用Na2SO4乾燥，過濾並濃縮後得到粗產物。層析(石油醚：醋酸乙酯，100：1至10：1)而得到21(38克)之黃色油。 實例6-製備中間化合物23-3
    在14(430毫克，0.38毫莫耳)、(DHQ)2PHAL(18.6毫克，0.024毫莫耳)、於第三丁醇中的四氧化鋨(0.156毫升，0.012毫莫耳)(2.5重量%，0.079毫莫耳/毫升)及甲磺醯胺(74毫克，0.77毫莫耳)於20毫升第三丁醇的攪拌溶液中，在室溫下加入鐵氰化鉀(382毫克，1.16毫莫耳)及碳酸鉀(160毫克，1.16毫莫耳)在20毫升水中的溶液，導致棕色乳化液。經2小時後，加入亞硫酸鈉之溶液，並持續攪拌20分鐘。將所得的混合物用醋酸乙酯(3x50毫升)萃取。將合併的有機層用鹽水清洗，經由無水流酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮，經由逆相快速層析法純化後得到23-2之白色固體。
    在23-2(240毫克，0.21毫莫耳)於24毫升THF與水的2：1混合物的攪拌溶液中加入過碘酸鈉(91毫克，0.42毫莫耳)。將所得的混合物在室溫攪拌3小時，且隨後加入飽和的碳酸氫鈉水溶液。將此混合物用三份醋酸乙酯萃取。將合併的有機層用一份水及兩份飽和的鹽水清洗，經由無水流酸鈉乾燥，過濾並在減壓下濃縮。將殘留物經由逆相快速層析法純化後得到23-3。 實例7-製備化合物24
    在21(42毫克，0.16毫莫耳)於THF(2.0毫升)的溶液中，在0℃加入在無水THF(0.2毫升)中的NaH(1.2毫克，0.05毫莫耳)並攪拌。然後將溶液在20℃攪拌直到其變成澄清。然後將23-3(30毫克，0.042毫莫耳)添加至澄清溶液中並將混合物在20℃攪拌2小時。將混合物用水(10毫升)淬滅並用醋酸乙酯(3x20毫升)萃取。將有機層用鹽水清洗並經由Na2SO4乾燥，過濾並在真空濃縮。將殘留物經由製備級HPLC純化後得到24之白色固體。 實例8-生物數據-HCV複製子及分析
    根據通則方法之說明，在基因型1b複製子測試法中使用Huh5.2細胞分析化合物。包含環脂素A 1、DEBIO-025 2、薩菲菌素A 5及羥基巨環6作為比較。
    可以看出，與CsA、Debio-025、SfA及羥基巨環比較，本發明化合物24在Huh5.2複製子測試法中明顯較佳(經由低EC50證明)，對抗細胞系明顯有較佳的選擇性(經由高選擇指數證明)。 實例9-生物數據-對抗HIV活性
    根據通則方法之說明，使用HeLa細胞在HIV抗病毒測試法中分析化合物。包含環脂素A 1、DEBIO-025 2、及HIV抗病毒恩曲他濱(emtricitabine)及泰諾福偉(tenofovir)作為比較。

    可以看出，本發明化合物24在此測試方法中，明顯比CsA、DEBIO-025、恩曲他濱及泰諾福偉更有效於抑制HIV感染。 實例10-生物數據-小鼠活體內口服及靜脈內藥物動力學
    為了評估化合物在活體內環境之藥物動力學，將化合物在10或5毫克/公斤口服或在1毫克/公斤靜脈內給藥至CD1小鼠。根據通則方法之說明而進行藥物動力學分析。PK參數顯示如下。
    可以看出，與薩菲菌素A比較，化合物24具有下降的清除並增加口服暴露(經由高po AUClast證明)。 實例11-生物數據-CypA PPIase活性之抑制作用
    使用在通則方法中說明之方法，評估CypA Peptidyl Prolyl順-反異構酶(PPIase)活性之直接抑制作用。包含環脂素A 1、DEBIO-025 2、及薩菲菌素A 5作為對照組。

    可以看出，本發明化合物24抑制CypA PPIase活性比薩菲菌素A、DEBIO-025及環脂素A更有效。 實例12-生物數據-膽紅素轉運體之抑制作用
    為了評估膽紅素轉運體之脫靶抑制作用，咸信是用DEBIO-025所見的劑量-限制性高膽紅素血症之原因，根據通則方法之說明而進行轉運體抑制作用之試管內分析。
    可以看出，與DEBIO-025及環脂素A比較，本發明化合物24顯示遠較低的共軛與非共軛膽紅素轉運體之抑制作用。 實例13-生物數據-外源化合物轉運體之抑制作用
    為了評估藥物藥物相互作用經由抑制外源化合物轉運體之可行性，根據通則方法之說明而進行P-糖蛋白(Pqp/MDR1)及Bile Salt Export Pump(BSEP)抑制作用之試管內分析。
    可以看出，與DEBIO-025及環脂素A比較，本發明化合物24顯示遠較低的可能涉及藥物藥物相互作用的外源化合物轉運體之抑制作用。 參考文獻
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    在此申請案中提到的包括專利及專利申請案的全部參考文獻是在最大可能範圍併於本文供參考。
    在整份專利說明書及隨後的專利申請範圍中，除非內容另外要求，名詞「包含(comprise)」及變化例如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」將可理解為意指包含一個所敘述的整數或步驟或整數群，而不是要排除任何其他整數或步驟或整數或步驟群。
    圖1係為化合物24之1H NMR。 序列表
    <110> Biotica Technology Limited Moss, Steven James Gregory, Matthew Alan Wilkinson, Barrie
    <120> 新穎化合物及其製造方法
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    <223> DNA片段
    <400> 8
    权利要求:
    Claims (8)
    [1] 一種式(I)之化合物： 包括其任何互變異構物；或其異構物(其中顯示反式的C26,27 C=C鍵是順式)；且包括其甲醇加成物，其中縮酮是經由結合C-53酮基(如果存在)及C-15羥基與甲醇而形成；或其藥學上可接受的鹽。
    [2] 根據申請專利範圍第1項之化合物，其係作為藥物。
    [3] 根據申請專利範圍第1項之化合物，其係作為供治療病毒感染例如HCV或HIV感染之藥物或作為免疫抑制劑或抗發炎劑。
    [4] 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1項之化合物以及藥學上可接受的稀釋劑或載劑。
    [5] 一種醫藥組成物，其包含根據申請專利範圍第1項之化合物以及藥學上可接受的稀釋劑或載劑，另外還包含第二或其他活性成份。
    [6] 一種治療病毒感染例如HCV或HIV感染或作為免疫抑制劑或抗發炎劑使用之方法，其包括將治療有效量之根據申請專利範圍第1項之化合物投藥至患者。
    [7] 一種製備根據申請專利範圍第1項的化合物之方法，其包括使式(V)化合物 其中各R11獨立地是C1-4烷基或苄基；與醛系巨環(式(VI)化合物)反應：
    [8] 一種式(VI)化合物：
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